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导读
肠道微生物组的组成与免疫检查点抑制剂(ICI)治疗的临床反应有关，但仍缺乏与ICIs临床益处相关的特定微生物组特征的知识。我们对ICI治疗前招募的晚期皮肤黑色素瘤患者(n=165)的五个观察队列的粪便样本进行鸟枪法宏基因组测序。通过将该数据集与147个先前发表的宏基因组样本相结合，我们发现肠道微生物组与ICIs反应具有队列依赖性相关性。机器学习分析证实了微生物组与ICIs的总体缓解率(ORRs)和无进展生存期(PFS)之间的关系，但也揭示了微生物组的特征在不同队列中的可重复性有限。因此，鉴定了一组与应答者相关的物种，包括假双歧杆菌、Roseburiaspp。和Akkermansia muciniphila，但在所有研究中，它们都不能被视为完全一致的生物标志物。一般来说，人类肠道微生物群在ICI反应中的作用似乎比以前认为的更复杂，超出了反应者和非反应者中存在或不存在的不同微生物物种。未来的研究应采用更大的样本量，并考虑治疗过程中临床因素和肠道微生物群之间的复杂相互作用。
论文ID
原名：交叉队列肠道微生物组与晚期黑色素瘤免疫检查点抑制剂反应的相关性
译名,的肠道菌群与晚期黑色素瘤免疫检查点抑制剂的临床反应相关。
：期刊自然医学
：53.44
IF：2022.4
发表时间：通讯作蒂姆D斯佩克特和林塞格塔
伦敦大学国王学院、荷兰格罗宁根者：,大学、意大利特伦托大学
通讯作者单位：10.1038/s 41591-022-01695-5
DOI号：
实验设计
总体而言，我们从英国、荷兰和西班牙的五个不同队列中招募了175名患者，他们都是III期和IV期皮肤黑色素瘤患者，在收集粪便样本后接受了ICI治疗(表1)。最初，我们集中于招募两个单一的准PRIMM队列，每个队列有超过50个样本。这两个队列的样本量超过了所有以前公布的数据集。在这些队列中，在治疗前和每个治疗周期纵向收集综合临床数据、标准化反应评估(RECIST v1.1)和生物样本。这两个队列之间存在统计学上显著的临床差异，包括过去接受系统性靶向治疗的受试者比例(PRIMM-NL为40%，PRIMM-UK为20%，P=0.03，Fisher精确检验)，以及BRAF突变肿瘤的比例(PRIMM-NL为55%，PRIMM-UK为31%，P=0.02，Fisher精确检验)。接受ICI治疗的患者比例(PRIMM-NL为22%，PRIMM-UK为53%，P=0.003，Fisher精确检验，补充表1)和M1d患者比例(PRIMM-NL为36%，PRIMM-UK为9%，P=0.005)由于这些原因，我们决定分别分析这些队列。所有样本均采用鸟枪法宏基因组测序，平均测序深度为7.74 Gb，通过严格质量控制的165个样本采用bioBakery 3进行分类和功能潜力水平分析。
结果
身体质量指数，身体质量指数；PFS12，无进展生存期12个月；质子泵抑制剂。
表1 通过RECIST v1.1研究开始时的患者特征、治疗细节和结果。
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首先，我们评估了与ORR相关的微生物组的定量分类组成，定义为在ICI治疗开始后6个月由RECIST v1.1评估的完全/部分缓解或疾病稳定性，并与先前微生物组-ICI研究的反应定义一致。使用这一定义，我们发现在PRIMM-UK队列中反应者和无反应者的微生物组组成存在统计学差异(PERMANOVA P=0.05，图1a)，但在PRIMM-NL中没有差异(P=0.61，图1a)。12个月无进展生存期(PFS12)定义为ICI治疗开始后12个月通过RECIST v1.1评估的完全/部分缓解或疾病稳定性的持续时间，适用于PRIMM-NL的所有患者和PRIMM-UK的98%患者，并显示出相似的关联模式(图1a)。人体测量因子(如身体质量指数(BMI)、年龄和性别)、既往非免疫治疗信息、既往药物治疗(如抗生素、质子泵抑制剂(PPIs)和类固醇)和食物频率问卷(FFQ)的饮食模式，将其转化为饮食指数(即改良地中海饮食评分和植物性饮食指数；补充表2)，在这些队列中收集了大多数患者的资料，并将其纳入多变量分析(图1b)。与单变量分析一致，我们发现在PRIMM-UK队列中，ORR和PFS12是解释最大变异的两个变量(分别为P=0.09和P=0.018)，而在PRIMM-NL中，我们发现PPIs、性别、东部肿瘤协作组体能状态和先前的抗肿瘤治疗显著解释了可能隐藏任何PFS12和ORR相关特征的差异(PERMANOVA P<0.05)。α多样性通常与ICIs的反应无关，在考虑混杂因素后，只有PRIMM-NL中的ORR在反应者中达到统计学上更高的Shannon多样性，但丰富度没有(扩展数据图1)。因此，我们注意到微生物群组成和群体特征之间关联的队列依赖性变异性，包括饮食模式的差异(补充图1)，这可以部分解释两个PRIMM队列中微生物组与ORR/PFS12之间联系的差异。
常见的β多样性汇总指标可能无法在整个微生物组水平上反映与反应相关的微生物组特征。因此，我们使用了基于Lasso的机器学习框架来评估微生物组的分类和功能特征组合的预测能力，以区分反应者和无反应者(方法与图1c)。在该框架中探索检测到的每种微生物物种的相对丰度时，我们发现使用PFS12为终点(受试者工作特征曲线下面积(AUC-ROC) 0.64)时PRIMM-NL和使用ORR(AUC-ROC 0.78)时PRIMM-UK具有相当强的微生物组预测能力。但PRIMM-NL中ORR和PRIMM-UK中PFS12的预测水平要低得多(分别为0.53和0.57)。然后，我们通过评估微生物基因家族(特别是京都基因和基因组百科全书(KEGG)直系同源家族)的存在和相对丰度来预测微生物组的功能潜力(图1c)。在本研究中，数据集和终点(ORR和PFS12)的AUC-ROC均超过0.59。当我们只考虑6至12个月间无进展的患者时(图1c)，预测能力在各队列间更加一致(使用物种时，PRIMM-NL为0.62，PRIMM-UK为0.71；当使用基因家族时，PRIMM-NL为0.68，PRIMM-UK为0.72)。当单独考虑时，临床元数据字段不能预测反应，也没有提供对微生物组特征的任何明显改善(扩展数据图2和3)，这表明这些相关性基本上不受潜在混杂因素的影响。这些研究结果表明，肠道微生物组确实与对ICI的反应相关，但似乎是队列依赖性的，这可能是由于微生物群落的特征与全球微生物组组成的巨大变化无关。
图1 在PRIMM-NL和PRIMM-UK队列中肠道微生物组与反应之间的关系。a ORR评估的反应与PRIMM-UK的整体微生物组结构相关(P=0.05)，但与PRIMM-NL或PFS12无关，如使用中心对数比转换的物种水平相对丰度的主成分分析(PCA)直观地表示。P值(Adonis，999 permutations)(扩展数据图2和3显示附加β多样性分析)。Dim1，维度1；Dim2，维度2。b多变量分析显示由每个确定的协变量解释的推断方差量(R2，蓝色竖条)及其各自的P值(橙色竖条)，由PERMANOVA通过中心对数比转换的物种水平相对丰度确定。c通过机器学习分析，微生物群的分类(物种丰度)和功能分析(KEGG直系同源物丰度)与反应之间的关联显示与两种反应类型(ORR或PFS12)的关联一致。“一致性”标签仅包括6至12个月之间无进展的患者。AUC-ROC曲线通过使用Lasso模型来计算，阴影区域代表每个机器学习模型的AUC-ROC。ICI表示伊匹单抗与纳武单抗联合使用或单药使用。AUC，曲线下面积；CV，交叉验证；hPDI：健康植物性饮食指数；PDI，植物性饮食指数；uPDI，不健康植物性饮食指数；mMED，改良地中海饮食评分。
2 跨队列反应预测的重复性有限
接下来，我们对PRIMM队列，还有来自巴塞罗那、利兹和曼彻斯特的三个较小的队列以及五个具有一致宏基因组和免疫治疗反应数据的公开可用队列进行了综合和交叉队列分析。除了PRIMM-UK和PRIMM-NL外，我们在此提供的三个队列共包含55个样本(表1)，其中包括收集了粪便样本并具有PRIMM队列可用元数据的患者。在这项分析中，我们还纳入了四个先前发表的队列，这些队列具有可用的宏基因组测序数据和ORR终点，两个具有可用的PFS12终点。正如预期的那样，不同的数据集在微生物种群中表现出强烈的队列依赖性效应，队列解释的方差几乎是任何其他变量的10倍(图2a)。将分析限制在我们测序的数据集上，批次效应不太强，但即使使用经验贝叶斯框架对中心对数比转换的物种水平相对丰度进行批量校正调整，ORR和PFS12仍然只能解释微生物组总变异的有限部分(图2a)，与α多样性的增加或减少无关(扩展数据图1b,c)。
接下来，我们评估了基于微生物组的机器学习模型是否以及如何预测分类模型训练中未考虑到的样本或整个队列中的ICI反应(图2b)。我们证实一些单一数据集的ORR预测水平高于PRIMM-UK(如Barcelona AUC-ROC 0.76)和PFS12预测水平高于PRIMM-NL (WindTT_2020 AUC-ROC 0.90)，但较高的AUC-ROC值通常对应于评估交叉验证时估计值变化更大的小队列，总体而言，其他队列的AUC-ROC值仅偶尔超过0.6(图2b)。
相同的样本量限制也可以解释当在一个队列上拟合反应特异性微生物组模型然后在另一个队列上进行测试时获得的AUC-ROC值；这些值仅在两个案例中达到0.7，在大约三分之一的案例(31.4%)中超过0.6，预测之间的差异很大。有趣的是，当模型适用于除一个队列外的所有队列并应用于被忽略的队列时，得到了更一致的结果，尽管其绝对值仍然有限(图2b)。在这种情况下，我们试图通过考虑同一模型中除一个队列外的所有队列来减轻队列特异性效应，我们在ORR和PFS12终点分别产生了平均为0.59和0.60的预测值，包含了大量重叠的数据集。通过酶学系统或KEGG同源数据库(KO)等分类分析的微生物组的功能特征在某些情况下与物种相对丰度相比实现了更高的反应预测(图2c和扩展数据图4)，但具有更高的可变性，因此队列间一致性更低。这些分类和功能预测(即使组合在一起；图2c)并不依赖于特定的机器学习方法，因为采用随机森林而不是Lasso产生了类似的结果(扩展数据图5)，总体而言，它们没有指出微生物组和ICI反应之间实质性的跨队列可重复联系。尽管如此，他们仍然强调，在一致的队列中对物种和基因家族水平的微生物组进行分析可以提供肿瘤对ICIs反应的相关指示。
图2 对新测序和公开可用的数据集进行跨队列反应-微生物组关联的综合分析。a变量对整体微生物群落组成的贡献突出了队列间微生物组结构的异质性，其影响远高于人体测量和临床参数。我们要么使用所有可用的队列，要么使用新排序的队列，其中有额外的元数据可用。在进行距离计算之前，对物种水平的丰度进行批量校正。左边的图采用ORR作为结果变量，右边的图采用PFS12。b通过ORR(左矩阵)和PFS12(右矩阵)在每个队列(对角线上的值)、交叉队列对和保留一个队列设置(在除一个队列外的所有队列上训练模型，并在被保留的队列上进行测试)下评估基于微生物组的反应预测矩阵。我们报告了从Lasso模型获得的物种水平相对丰度的AUC-ROC值。扩展数据图4中提供了使用功能微生物组的相同预测矩阵。c ORR(n=284)交叉验证从Lasso模型(箱形图)获得的AUC-ROC值。箱线图的下限和上限分别对应于第一四分位数和三四分位数；中线是中间值；上下线段为最大(或最小)值。EC，酶分类。
3 跨队列反应的重复生物标志物很少
然后，我们在与ORR和PFS12相关的可用队列中寻找与ICIs反应一致相关的微生物分类群或功能(图3，扩展数据图6和补充表3和4)。该分析揭示了与反应相关的两种未培养罗氏菌属(Roseburia)物种；Roseburia sp. CAG:182(也与使用PFS12时的反应相关)和Roseburia sp. CAG:471在ORR终点可用的所有数据集中的反应者平均增加。值得注意的是，最近一项大型宏基因组人群研究发现，Roseburia sp. CAG:182在与有利的营养和心脏代谢健康标志物最相关的五种细菌物种中，与炎性替代糖蛋白乙酰具有特别强的负相关性。对于那些可以获得PFS12数据的患者，Phascolarctobacterium succinatutens和阴道乳杆菌(Lactobacillus vaginalis)在所有7个数据集中均有反应者，并且使用相同显著性阈值的8种meta分析方法中的3种方法检测出两者具有显著性。与ORR和PFS12(分别采用3种和6种meta分析方法)相关的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(A. muciniphila)和Dorea formicigenerans是两种总体患病率较高的物种(分别为65.8%和85.9%)。相反，在ORR和PFS12的所有7个数据集中，Bacteroides clarus在无反应者中显示出更高的相对丰度，并且在协变量校正后与PRIMM-NL中的无反应者显著相关(图3d)。没有一种细菌是所有数据集中完全一致的反应生物标志物；然而，在结直肠癌的背景下应用相同的meta分析方法作为方法对照，证实了跨队列的强大且一致的生物标志物，加强了之前的meta分析(扩展数据图7和补充表5)。然后，我们通过至少三种meta分析方法对与反应者相关的物种进行了分析，这与贝叶斯框架的组成测序数据结果高度一致(Pibble模型；补充图2)。该小组包含了通常与健康宿主条件相关的分类群，包括具有益生菌潜力的物种(假小链双歧杆菌Bifidobacterium pseudocatenulatum、Lactobacillus ruminis和Turicibacter sanguinis)，以及参与丁酸盐产生的物种(Roseburia spp.、Eubacterium hallii和Butyricimonas synergistica)。A. muciniphila也属于该组，在PRIMM-NL研究中也有显著相关性，这支持了之前关于其在免疫治疗中的作用的发现，但在PRIMM-UK中，Ruminococcus gnavus作为无反应者的生物标志物与多篇关于其与心脏代谢健康不良和几种疾病相关的报道相一致。将我们的分析扩展到细菌和古菌以外的肠道微生物组成员，我们发现ICI反应与Blastocystis(8.9%的个体是Blastocystis阳性，这是发现的真核生物的最高患病率；补充表6)或病毒的存在之间没有关联(补充图3)。
当使用肠道微生物组的预测功能潜力评估治疗反应时，我们发现许多KOs在反应者中增加(补充表7和8)。其中包括一种已知对表膜形成必不可少的糖基转移酶(epsJ)，其主要来自Intestinimonas butyriciproducens、Bifidobacterium angulatum和Bifidobacterium pseudoangulatum，并且在所使用的八种meta分析方法中的六种方法中具有显著性(图3c)。我们还在使用ORR(图3c)和PFS12(扩展数据图8)的反应者中检测到DNA腺嘌呤甲基化酶的丰度增加，这是限制性修饰系统的一部分，可以影响毒力基因的表达，主要来源于I. butyriciproducens。我们还发现无反应者中的葡萄糖酸转运体增加，主要来自Rumminococcus torques、大肠杆菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。葡萄糖酸盐是粘蛋白2的重要组成部分，参与鞭毛的结合。
图3 一组跨队列反应的潜在分类和功能微生物组生物标志物。a通过使用不同差异丰度方法进行meta分析确定与ORR相关的物种。显示的物种在至少三种方法中具有随机效应模型P< 0.05。单元格内的值是指未校正的小于0.05的P值，通过对反应者和无反应者的相对丰度差异进行双尾Wilcoxon检验获得。通过比较反应者与无反应者的平均相对丰度来确定单元格的颜色；如果反应者的平均值较高，则单元格呈红色；如果在无反应者中较高，则单元格呈蓝色。b通过使用不同差异丰度方法进行meta分析确定与PFS12相关的物种。显示的物种在至少三种方法中具有随机效应模型P<0.05。单元格内的值是指未校正的小于0.05的P值，通过对反应者和无反应者的相对丰度差异进行双尾Wilcoxon检验获得。c通过使用不同差异丰度方法进行荟萃分析确定与反应状态相关的KOs。所示的KEGG直系同源物在至少六种方法中具有随机效应模型P<0.05。单元格内的值是指未校正的小于0.05的P值，通过对反应者和无反应者的相对丰度差异进行双尾Wilcoxon检验获得。d在调整包括PPI、抗生素和类固醇使用在内的协变量之前和之后，两个PRIMM队列(PRIMM-NL n=47)和PRIMM-UK n=53)中与ORR相关的物种；性别、体能状态绩；既往治疗；年龄和ICI。显示的物种在ANCOM-BC确定的其中一个队列中具有协变量调整的多重假设检验校正q<0.2。符号(圆圈和三角形)显示ANCOM-BC β系数，误差线代表标准误差。Adj，校正；NR，无反应者；R，反应者；SMD，标准化平均差。
4 与微生物组相关的临床参数
不可切除的晚期黑色素瘤患者具有潜在的临床混杂因素，这些因素可能会影响微生物组，并可能混淆ICI治疗前微生物组组成与临床反应之间的关联。在我们的队列中，从治疗前PPI的使用到体能状态和毒性，一系列一致的临床信息使我们能够测试这些参数是否以及如何与微生物组组成和对ICIs反应的微生物组特征相联系。与之前的报告一致，我们发现PPIs在PRIMM-NL和PRIMM-UK中与微生物组的关联最强(图4a)；但PPI的使用与反应或PFS12无关(扩展数据图9)，因此，其本身并不是影响微生物组-反应相关性的因素。此外，PRIMM-UK的ORR达到了基于分类学微生物组模型的相同预测水平，这证实了反应-微生物组特征与PPI使用无关，因为在ICI治疗前报告使用PPI的无反应患者的重叠有限(P=1，Fisher精确检验)。在观察功能潜力时，我们还发现PPI的使用是肠道微生物组在两个PRIMM队列的保留数据集中最佳预测的协变量(扩展数据图9)。在考虑保留一个数据集策略时，从PRIMM-UK和PRIMM-NL的微生物组中也可以很好地推断出体能状态(图4a和扩展数据图9)。在本研究中，ICI诱导的毒性和结肠炎(初级免疫学、基因组学和微生物学生物标志物)与微生物组的相关性较小，PRIMM-UK和PRIMM-NL中分别有43%和36%的个体经历了3级或更高级别的免疫相关不良事件(方法)。在PRIMM-NL中，E. hallii和Anaerostipes hadrus都被发现与ICI治疗前结肠炎的消失显著相关，而PRIMM-UK样本的分析中没有发现显著相关的物种。Bacteroides clarus与PRIMM-UK中ICI诱导毒性的发展显著相关，也与PRIMM-NL和meta分析中的无反应相关。直肠真杆菌(Eubacterium rectale)与PRIMM-NL中无毒性显著相关(在PRIMM-UK中无显著性)，并在PRIMM-UK和PRIMM-NL中使用PFS12时与反应相关(扩展数据图8)。总体而言，本研究发现一些临床参数与肠道微生物组的组成有关，但这种关联似乎与ICI反应无关。
图4 与来自PRIMM队列的肠道微生物组的协变量关联。a交叉验证从Lasso模型中获得的AUC-ROC值。箱线图的下限和上限分别对应于第一四分位数和三四分位数；中线是中间值；上下线段为最大(或最小)值(PRIMM-NL n=55；PRIMM-UK n=55)。b-d ANCOM-BC确定的与PPI使用、毒性和结肠炎相关的物种(ICI开始后3个月内)，有或没有协变量调整(PRIMM-NL n=47；PRIMM-UK n=53)。所有模型中纳入的协变量包括ORR、体能状态、既往治疗、年龄、ICIs(伊匹单抗和纳武单抗联合使用或单药使用)、性别、抗生素和类固醇使用情况。在分析结肠炎和毒性时，PPI的使用也被纳入协变量。显示的物种在ANCOM-BC确定的其中一个队列中具有协变量调整的多重假设检验校正q<0.2。符号(圆圈和三角形)显示ANCOM-BC β系数，误差线代表标准误差。
讨论
在本研究中，我们提出了迄今为止最大的宏基因组研究，通过整合已发表的黑色素瘤队列(n=147)和5个新队列(n=165)来确定肠道微生物组与ICI反应的相关性。对这一庞大的队列进行了meta分析，扩展了之前的尝试，以验证在单个小数据集中发现的对ICI反应的部分冲突生物标志物是否可以调和。分别在6个月和12个月使用RECIST v1.1的ORR和PFS12作为终点，我们确认了在所有数据集上一致的队列特异性生物标志物的存在和分类或功能微生物组生物标志物的缺失。缺乏可靠的交叉研究可重复性ICI反应微生物生物标志物不能归因于分析选择，因为在结直肠癌的背景下应用相同的meta分析方法证实了在其他队列中描述的强大且一致的生物标志物。通过机器学习分析证实了与肿瘤对ICIs反应相关的微生物组的可变性，这表明微生物组可以预测一些(但不是所有)队列中的反应。重要的是，跨队列预测的任务是在不同于开发机器学习模型的队列中识别ICI反应者和无反应者，这表明要克服人群和微生物组异质性的限制来可靠地预测反应仍然非常困难。尽管通过粪便微生物群移植试验，我们证实了微生物组具有支持黑色素瘤患者临床治疗的潜力，但在我们找到强有力的微生物生物标志物之前，还需要克服一些局限性。
将ICI与肠道微生物组联系起来存在多种局限性。尽管本研究中增加了新的内容，但每个单独队列的样本量相当小，这当然是一个方面，但在这种临床环境中收集非常大的、正确注释的样本量本质上是困难的。我们的工作还强调了以前在定义反应方面被忽视的局限性(同一队列中微生物组与ORR和PFS12的联系差异)，以及难以校正的大量潜在混杂因素。此外，即使在多中心研究中，通常很强的队列微生物组效应在分析的黑素瘤ICI治疗试验中似乎比在其他临床环境中更强。目前用于分析肠道微生物组的方法可以深入研究微生物群落的分类和功能，但通常缺乏在免疫界面上描述微生物组特征的能力。
目前尚不清楚为什么PFS12在PRIMM-NL中具有更高的微生物组预测能力，而ORR在PRIMM-UK队列中表现得更好。除了合并队列的大样本量外，我们的研究还具有多种优势；本研究的样本来自三个欧洲国家和一些公开可用的数据集，代表了现实世界患者的多样化和异质队列，我们考虑了各种经常被忽视的重要混杂因素和预后因素。
正如我们在本研究证实的那样，肠道微生物组在ICI反应中发挥着重要作用，但这一作用似乎比之前在初步研究中报道的更为复杂，超出了微生物丰度的差异，并涵盖了肠道微生物组与临床预测因子和生物因素的复杂相互作用，这可能特定于从ICIs治疗获益的患者的地理位置。即使考虑到同卵双胞胎，每个个体的肠道微生物群都是独一无二的，而且这种独特性很大一部分是在单个菌株水平上编码的。因此，需要分析方法来更深入地探索这种个体特异性微生物多样性，但这种分辨率也需要数千个个体的样本量，以应对相关微生物特征数量的大幅增加。了解肠道微生物群的功能输出、特定微生物群与宿主之间在菌株水平上存在的免疫学关系，甚至可能检查与粪便不同的肠道粘膜，将使我们进一步了解肠道微生物组影响ICIs治疗的机制。肠道微生物组和ICI反应之间的关联也可能在一定程度上是癌症特异性的，并且受到许多固有的难以解释的因素的影响，因此，重要的是将分析和meta分析扩展到黑色素瘤的皮肤亚型之外以包括葡萄膜和粘膜亚型以及其他可用ICI治疗的癌症。即使在相同的癌症(亚)类型中，相同的微生物组特征也不太可能反映每个肿瘤的遗传和免疫特征的特异性，这意味着对人类微生物组和ICI反应之间存在普遍、非常准确和高度可重复的关联的期望应该降低。因此，应继续努力在更大的范围内进行宏基因组研究，提高不同人群的代表性，同时控制临床协变量并确保以相同的方式和使用相同的技术收集和处理样本。这项研究提高了目前对肠道微生物组与ICI反应之间联系的理解，并阐明了人类疾病中微生物组科学的复杂性。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41591-022-01695-5
