本期《精准前沿》栏目分享美国哈佛医学院Toni K. Choueiri、Sachet A. Shukla、Catherine J. Wu研究团队联合发表于Nature Medicine（IF =53.440）上的一篇研究[1]，研究利用全外显子和RNA-seq测序技术，并结合多重免疫组化，对参与PD-1阻断治疗临床试验中的肾透明细胞癌晚期患者进行分析，发现体细胞改变和免疫浸润的相互作用调节晚期肾透明细胞癌对PD-1阻断的应答。
研究背景
免疫检查点抑制剂（ICI）已经成为许多癌症治疗的关键部分。PD-1阻断在晚期肾透明细胞癌（ccRCC）的治疗中具有特别的变革意义。在实体恶性肿瘤中，对PD-1阻断的应答与许多肿瘤固有特征，例如，高肿瘤突变负荷和高新抗原负荷和微环境特征（增加T细胞浸润）有关。与大多数其他类型的抗PD-1应答实体肿瘤相比，ccRCC只有不太多的突变负荷。此外，在这种情况下，CD8+ T细胞的高度浸润与预后不良相关。以前的ccRCC的遗传特征研究对我们了解其肿瘤生物学及其疾病进展有很大的贡献, 但基因组变化的作用和免疫渗透模式在PD-1阻断反应的作用仍不明确。
研究设计
该研究对592例晚期ccRCC肿瘤患者进行了遗传、转录组学和免疫病理的分析，从三个PD-1阻断的前瞻性临床试验（其中一个研究在对照组中使用mTOR抑制）中提取数据。该分析揭示了晚期ccRCC中体细胞改变的情况，并确定了与ccRCC中免疫浸润模式和PD-1阻断的临床结局相关的拷贝数变化。
研究结果
1. 晚期肾透明细胞癌的基因组特征
作者通过应用MutSig2CV20，鉴定了17个反复突变的基因（Q<0.05），其中11个基因突变在至少10例患者样本中都有突变（图1b）。与之前的大规模测序研究一致，这些晚期ccRCC队列中最可能的候选驱动因素是VHL（65%）、PBRM1（33%）、SETD2（25%）、BAP1（19%）和KDM5C（13%）。还发现了PI(3)K-AKT-mTOR通路中常见的体细胞单核苷酸变异（sSNVs），包括mTOR（9%）、PTEN（6%）、TSC1（3%）和PIK3CA（3%）突变。又通过GISTIC2，发现几乎所有的样本（95%）都有染色体3p缺失，作者认为这是ccRCC的一个典型特征，经常与5q获得同时发生。还检测到9p（65%）和14q（68%）的高频率缺失，这些之前被认为是ccRCC转移的标志性驱动因素（图1b）。
图1. 体细胞突变
为了确定晚期ccRCC（IV期）是否比早期（I-III期）疾病在特定的体细胞突变更丰富，作者比较了来自CheckMate队列的数据和TCGA ccRCC数据。最常见的显著突变基因（VHL, PBRM1, SETD2, BAP1, KDM5C）在早期和晚期患者中都有发生（图2a）。作者还发现NF2突变与ccRCC的预后不良有关，PD-1阻断似乎可以消除这一现象（图2b）。
图2. 晚期肾透明细胞癌基因特征
2. 体细胞突变负荷和HLA接合性与治疗结果无关
在该研究队列中，非同义突变的总数、新抗原、移码突变和体细胞拷贝数改变与PD-1阻断或mTOR抑制的临床反应或生存率提高有关。种系因素，如HLA I类基因型，可以影响免疫原性抗原的表达能力，因此也可能影响对PD-1阻断的应答。然而，在这些ccRCC队列中，我们没有发现最大HLA I类杂合度（即HLA-A、HLA-B和HLA-C杂合度）与PD-1阻断提高生存率之间的任何关联（图3e）。
图3. 体细胞突变负荷和HLA结合性与PD-1阻断的临床相关性
3. 抗PD-1治疗反应和耐药的基因组相关性
通过对三个队列（主要包括以前治疗过的抗血管生成难治性患者）的合并分析再次表明，PBRM1的删除突变可改善应答和生存率（P<0.001;OS）。另外，作者也发现PBRM1的改变与更高的血管生成基因表达相关，但IL6-JAK-STAT3信号通路评分较低。没有其他复发的sSNVs或sIndels与PD-1阻断后生存率的提高相关。在显著复发的体细胞拷贝数改变（sCNAs）中，只有10q23.31的病灶损失与PD-1阻断后PFS和OS的改善有关，但与mTOR抑制无关。通过基因集富集分析（GSEA），使用来自分子特征数据库（Molecular Signatures Database）的50个Hallmark基因集，带有del（10q23.31）的ccRCC肿瘤并没有显示出mTOR通路活性的增加，这与PTEN缺失在这些患者中的功能性作用相反。唯一与10q23.31缺失相关的富集基因集是Hedgehog信号传导（Q = 0.18）。值得注意的是，包括SUFU和BTRC在内的多个Hedgehog信号的负调控因子位于染色体10q，稍远于PTEN（10q24.32），因此，可能在这些病人中起作用。相比之下，抗PD-1治疗后，没有与PFS和OS相关的染色体增益。
图4. 抗PD-1治疗反应和耐药的基因组相关性
4. 基线CD8+ T细胞浸润不能预测对PD-1阻断的应答
为了建立晚期ccRCC中CD8+ T细胞的浸润模式，并探讨其与抗PD-1治疗应答的关系，该研究对219例肿瘤样本（153例PD-1阻断治疗，66例mTOR抑制治疗）进行了CD8免疫荧光分析，量化肿瘤中心和肿瘤边缘CD8+细胞密度。肿瘤被分类为“免疫排除”（CD8+ T细胞至少多5倍），“免疫荒漠”（不排除，CD8+ T细胞低于第25百分位，肿瘤中心50个细胞/mm2），或“免疫浸润”（不排除，肿瘤中心CD8+ T细胞处于或高于第25百分位）。与尿路上皮癌不同，只有5%的ccRCC是“免疫排除”型，而大多数（73%）是免疫浸润（中位数= 155个CD8+ T细胞/mm2）。通过对转录组的免疫反褶积计算（使用CIBERSORTx）（图5b），观察到“浸润”型肿瘤中富含M1巨噬细胞、激活的CD4+记忆T细胞和激活的NK细胞。相比之下，CD8+“沙漠”和“排除”型肿瘤中富集M2巨噬细胞、静息CD4+记忆T细胞和静息NK细胞。这与之前的研究一致，CD8+ T细胞浸润与表达抗肿瘤标志物的NK细胞、CD4+ T细胞和巨噬细胞有关。然而，使用转录组数据推断免疫细胞浸润可能导致错误分类。
另外，在抗PD-1治疗或mTOR抑制的患者中浸润、沙漠或排除肿瘤的比例在不同临床获益的情况中没有差异。在接受PD-1阻断或mTOR抑制治疗的患者中，不同免疫表型之间的PFS或OS没有差异。此外，作者评估了大量免疫相关基因表达signature，但未观察到signature高表达与抗PD-1治疗改善应答或生存之间的任何关联。
图5. 基线CD8+ T细胞浸润不能预测对PD-1阻断的应答
5. 免疫表型和体细胞改变的相互作用影响对PD-1阻断的应答
鉴于免疫排斥和荒漠表型（“非浸润”）的肿瘤对PD-1阻断的反应与CD8+ T细胞浸润的肿瘤相似的发现，作者研究了在不同免疫亚型的情况下，是否有任何肿瘤固有特征影响应答。因此，系统地评估了在浸润或非浸润肿瘤中优先富集的体细胞突变。在复发的sSNVs和sIndels中，只有PBRM1的删除突变在非浸润性肿瘤中富集，而在浸润性肿瘤中没有突变富集。与此结果一致的是，PBRM1突变的肿瘤CD8+ T细胞浸润总量较低。至于sCNA，在非浸润性肿瘤中没有富集，但多局灶性染色体丢失或者在浸润性肿瘤中更常发现增益（例如12q24.32、20q13.33和8q24.3扩增；9p21.3、9q34.3、6p22.2、6p21.32缺失；Q< 0.05）。浸润性肿瘤的wGII（基因组不稳定性）高于非浸润性肿瘤（P = 0.01）。然而，在浸润性肿瘤中，染色体不稳定程度（wGII高vs低）与生存无关。
由于总拷贝数负荷并不影响生存，作者探索了是否有单个染色体的丢失或获得（i）在浸润性肿瘤中富集，（ii）与浸润性肿瘤中PFS和OS的改变相关。在染色体缺失中，只有del（9p21.3）在浸润性肿瘤中富集，并且在PD-1阻断的浸润性肿瘤中也与较差的PFS和OS有关，而与mTOR抑制无关。在GSEA中，9p21.3缺失的肿瘤mTOR信号通路增加，这之前被证明（通过PTEN缺失）与抗PD-1治疗的耐药性相关。在9p21.3缺失中，多个其他标记基因signature富集，包括血管生成、缺氧和糖酵解，增加了多种生物过程可能导致抗PD-1治疗的染色体改变患者预后不良的可能性。
图6. 免疫表型和体细胞改变的相互作用影响对PD-1阻断的应答
讨论
文中提到几个重要的局限性。在整体基因组和转录组分析中存在固有限制，最终需要单细胞转录组方法来全面了解肿瘤和免疫细胞组成和细胞状态，并充分剖析这些定义的免疫表型内的异质性。此外，基因组和免疫评估是基于每位患者的单个肿瘤样本，这可能无法捕获ccRCC中发现的全部基因组异质性或其他肿瘤类型中描述的潜在免疫异质性。关于治疗环境，这些临床研究是在之前治疗过的抗血管生成难治性环境中进行的，之前的基于抗PD-1的一线治疗研究并没有证明PBRM1突变在一线治疗中有益。此外，PBRM1突变改变PD-1阻断反应的确切机制仍未明确。与之前的研究一致，PBRM1改变与更高的血管新生基因表达相关; 然而，与过去的报道相比，我们发现PBRM1改变与较低的IL6 JAK STAT3信号有关，这可能与队列的差异(包括免疫浸润的差异)或FFPE组织转录组分析的局限性有关。由于大多数存档的(抗血管生成治疗前)肿瘤标本可供研究，并非所有肿瘤在组织取样时都处于晚期，体细胞改变和免疫浸润可能在PD-1阻断之前进一步进化，目前的研究无法捕捉到这些变化。此外，具有特别侵袭性疾病的患者可能无法存活足够长的时间来参加这些试验，因此这种类型的ccRCC患者不会被纳入我们的分析。最后，我们的研究只检查了透明细胞组织学，但对非透明细胞RCC的认识和治疗还没有满足临床需要。
尽管如此，该研究为ccRCC中免疫治疗应答和耐药的免疫基因组机制提供了重要的见解。随着这些方案已经成为晚期ccRCC患者的标准一线治疗选择，在未来的临床试验中验证这些发现，并探索免疫浸润和体细胞改变在抗PD-1联合治疗背景下的相互作用将是至关重要的。考虑到联合治疗中药物与药物相互作用的复杂性，疗效的提高可能来自于独立、相加或协同效应，为了更好地理解这些药物联合治疗的效果，首先了解抗PD-1单药治疗的潜在反应和耐药性的生物学基础是至关重要的。这项研究产生的详细的临床、基因组、转录组和免疫病理学数据将成为癌症免疫学界的宝贵资源。因此，这项工作对于正在进行的精准医学和免疫肿瘤学的倡议将是重要的，它有助于识别哪些患者可能对当前的疗法有反应，并为帮助开发合理的联合疗法以克服未来的耐药性提供基本信息。
结语
这项研究为肾透明细胞癌中导致免疫应答和耐受性的免疫基因组机制提供了重要见解。所产生的详细的临床、基因组、转录组学和免疫病理学数据也将为癌症免疫学界提供宝贵的资源。因此，这项工作对于正在进行的精准医学和免疫肿瘤学研究至关重要，有助于鉴定哪些患者可能对当前疗法产生应答，而且也为助力将来开发克服耐药性的合理联合疗法提供了基础信息。
END
参考文献： [1] Braun， D.A.， Hou， Y.， Bakouny， Z. et al. Interplay of somatic alterations and immune infiltration modulates response to PD-1 blockade in advanced clear cell renal cell carcinoma. Nature Medicine (2020). doi.or g/10.1038/s41591-020-0839-y
撰写丨DLD
编辑、排版丨SX
