科研 | Sci Total Environ：宏基因组学结合100个组装基因组（MAGs）揭示N2O排放功能基因及菌群的多样性

魏《文水》编，穆、蒋舜尧主编。

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导读

南极土壤温度通常较低，可利用的液态水和养分有限。然而，南极动物可以通过排泄为无冰陆地增加营养。在这项研究中，我们采用了

or: rgb(2, 30, 170);">鸟枪法宏基因组测序（shotgun metagenomics）结合种群基因组分箱（genome binning）技术，研究了鳍足类动物干扰、鸟类干扰和无动物干扰下南极土壤微生物群落分类和功能的多样性。我们获得了~285000个携带16S rRNA的宏基因组序列，其代表~60个细菌门以及100个宏基因组组装基因组（MAGs，8个门），100个MAGs中只有9个包含的物种曾被报道，说明南极土壤包含许多新的未知物种（参与氮循环）。南极土壤中的优势菌有Proteobacteria（变形菌门）、Actinobacteria（放线菌门）和Bacteroidetes（拟杆菌门）；鸟类干扰下土壤中最优势的菌为Rhodanobacter（罗丹杆菌属），并且其反硝化相关基因数量是无动物干扰土壤中的两倍。本研究发现了南极无冰区参与氮循环的新型微生物，有助于人类了解海洋动物干扰下南极土壤氮循环功能微生物以及温室气体（N₂O）排放的响应趋势。

论文ID

原名：Negative effects of multiple global change factors on soil microbial diversity

译名：宏基因组学结合100个组装基因组（MAGs）揭示N₂O排放功能基因及菌群的多样性：基于海洋动物干扰下的南极土壤

期刊：Science of The Total Environment

IF：7.963

发表时间：2021.05.12

通讯作者：Julieta Orlando

通讯作者单位：智利大学

实验设计

图文摘要

结果

1. 南极土壤的理化性质及宏基因组测序概况

本研究的土壤样本具有高度的空间异质性，因此不同样本间土壤因子的理化指标差异较大（表1）。尽管如此，我们仍观察到鸟类干扰的土壤比无动物干扰的土壤具有更高的含水量（p=9.4e-4和6.6e-4）、有机质含量（p=3.4e-4和8.5e-4）和磷含量（p=3.9e-3和6.1e-5）。此外，鸟类干扰的土壤比无动物干扰的土壤有更高的硝态氮（p=4.5e-3），并且三种土壤的铵态氮含量也有显著差异（表1）。

本研究将每个采样点的3个重复混合后进行测序，对Pp_LI的2个样本各自测序以作质控，结果共获得10个宏基因组数据集。每个样本序列在50000000~80000000之间，大小为7.7~12.1Gbp，质控后平均读长达到~145bp。每个数据集中约有8%的序列用于MAGs（宏基因组组装基因组）组装（补充材料表A1），这说明本研究样本的微生物群落高度多样化。

对比不同类型土壤的微生物群落发现：基于MASH距离的NMDS分析中，动物干扰的土壤微生物群落与无动物干扰的土壤微生物群落明显分开。但是，PERMANOVA结果（补充材料表A2）显示，三种土壤（即鸟类干扰的土壤、鳍足类动物干扰的土壤、无动物干扰的土壤）的微生物群落分布无显著差异，这可能是样本量较小导致。此外，Monte Carlo检验结果显示（补充材料表A3），本研究的土壤因子指标对微生物组成的解释率较低。

2. 动物干扰下南极土壤微生物的分类多样性

本研究共鉴定出284625个16S rRNA基因序列，以97%的相似性进行OTU聚类，共得到16028个OTUs（其中有23%序列未达到阈值）。结果显示，有无动物干扰下，土壤微生物群落的多样性没有显著差异（补充材料表A4）。与此结果一致的是，不同类型土壤间的 Nonpareil 多样性指数（Nd）或覆盖度也不显著（补充材料表A1）。Nonpareil曲线（补充材料图A1）和覆盖度（补充材料表A1）结果显示，无动物干扰土壤的微生物平均覆盖度为0.33（即任意外来序列有~30%的可能性与已测序列重叠），而鳍足类动物干扰土壤的微生物平均覆盖度为0.55，鸟类干扰土壤中为0.63。上述结果说明，由于样本量较少、样本间异质性较大，导致不同类型土壤的微生物多样性的差异未达到显著。

基于16S rRNA基因序列的微生物群落组成结果显示，南极土壤的优势菌分别为Proteobacteria（变形菌门，~32%）、Bacteroidetes（拟杆菌门，~26%）和Actinobacteria（放线菌门，~20%），但是，不同类型土壤间微生物的相对丰度没有显著差异（图2）。利用DESeq2（p<=0.05；Bonferroni校正）进一步确定不同类型土壤间OTUs的差异。结果发现，在无动物干扰的土壤中，有132和29个OTUs的丰度分别高于鸟类和鳍足类动物干扰的土壤（补充材料表A5）。具体而言，在无动物干扰的土壤中，属于Gaiellaceae科和Nitrososphaeraceae科的OTUs丰度更高。此外，鸟类干扰的土壤中有8个OTUs的丰度别高于鳍足类动物干扰的土壤，这些OTUs主要属于Rhodanobacter属、Dokdonella属和Candidatus Aquiluna属（补充材料表A5）。

图1. 南极South Shetland群岛的采样点分布，包括：King George乔治王岛的Fildes半岛、Ardley半岛，以及Livingston利文斯顿岛的Shirreff角。图中彩色点对应无动物、鸟类或鳍足类动物干扰的土壤。

图2. 南极土壤宏基因组测序柱形图揭示微生物的群落组成。柱形图展示16SrRNA基因的物种相对丰度（门水平）。每种颜色代表一个门。下方条带代表不同的土壤类型：蓝色，鳍足类动物干扰的土壤；红色，鸟类干扰的土壤；绿色，无动物干扰的土壤。

3. 动物干扰下南极土壤微生物的功能多样性

为评估南极土壤微生物群落的功能多样性，我们对contig重叠群的蛋白质编码基因进行SEED分类。结果显示，每个宏基因组组装后有303335个注释基因，占总预测基因的46%~51%（补充材料表A6）。高丰度基因包括辅酶因子、维生素、辅基、色素、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、氨基酸及其衍生物的代谢相关的基因。DESeq2分析结果显示，不同类型土壤间有223个基因（占13.3%，原有1667个）的丰度存在显著差异（p<1e-03；Bonferroni校正）。对三种土壤（无动物干扰、鳍足类动物干扰和鸟类干扰）的子系统丰度进行两两比较（补充材料表A7），结果显示，与鳍足类动物干扰和鸟类干扰土壤的子系统相比，无动物干扰的土壤中有3个子系统丰度最高，分别是：（1）关联核糖体蛋白L28P和一组未鉴定蛋白联的革兰氏阳性簇，（2）ABC转运蛋白寡肽(TC3.A.1.5.1)，和（3）包含肽酶、核糖体蛋白、核黄素代谢组分以及多核糖核苷酸转移酶的CBSS-350688.3.peg.1509。相比之下，鳍足类动物干扰和鸟类干扰土壤也有3个子系统丰度最高，分别是（1）N-ATPase，（2）“Murein”水解酶调控和细胞死亡，以及（3）鞭毛运动。此外，与鳍足类动物干扰的土壤相比，无动物干扰的土壤中与子系统：（1）核糖体SSU真核生物和古菌，（2）核糖体LSU真核生物和古菌，以及（3）辅酶F420变化（分别为6.15、5.91和2.77）最为相关。特别的是，鸟类和鳍足类动物干扰的土壤中反硝化相关基因分别是无动物干扰土壤中的2.12倍（p=2.6e-07）和1.7倍（p=0.011）。此外，鳍足类动物干扰的土壤中尿素分解相关基因是鸟类干扰土壤中的3.10倍（p=6.6e-03）。

4. 宏基因组组装基因组（MAGs）的构建

本研究中，10个宏基因组数据集共构建出100个MAGs。这些MAGs的平均完整性为83.9%，污染度为4.3%，质量为63%，在AAI算法中，MAGs共有蛋白的利用率占所有MAGs基因组总蛋白序列的40%以上（补充材料表A8）。 AAI 基因组比对后，有50个 MAGs 属于变形杆菌门（Proteobacteria，26个β-、22个γ-、1个α-、1个Delta-变形菌），22个属于放线菌门（Actinobacteria），15个属于拟杆菌门（Bacteroidetes），6个属于厚壁菌门（Firmicutes），4个属于芽单胞菌门（Gemmatmonadetes），1个属于异常球菌-栖热菌门（Deinoces-Thermus），1个属于螺旋体菌门（Saccharteria），1个属于疣微菌门（Verrucomicrobia）。所有样品中有7个MAGs携带Rhodanobacter denitrificans和CandidatusTremblaya princeps，，6个MAGs携带Dokdonella koreensis（图3）。

在所有宏基因组数据集中，Ct_LI、Ct_KGI和Ml_KGI组装出的MAGs最少（分别为4个、4个和1个），这与其较低的覆盖度相一致；而动物干扰的样品中组装出的MAGs较多（10个左右）。AAI基因组比对后共获得的100个MAGs，，其包含了2个新科，18个新属和71个新种。

图3. 南极土壤宏基因组测序热图揭示宏基因组组装基因组（MAGs）和氮循环基因的相对丰度。左侧为样品中MAGs的相对丰度，以基因组当量对平均测序深度（TAD80）进行标准化处理。右测为MAGs中参与不同氮循环过程的基因拷贝数，包括：反硝化过程（napA、narG 、 nirS、nirK、norB和nosZ）、硝化过程（amoA、hao和nrx）和硝态氮异化还原为铵，即DNRA过程（nrfA）。最左侧条带代表不同的土壤类型：蓝色，鳍足类动物干扰的土壤；红色，鸟类干扰的土壤；绿色，无动物干扰的土壤。最右侧为MAGs中发现的新型未知物种，以NCBI数据库中最近缘的细菌命名。

5. 动物干扰下南极土壤中与N₂O排放相关的氮循环过程

我们利用所有基因组（未组装基因组短序列和组装的MAGs）评估参与N₂O排放相关的氮循环基因的相对丰度。基于未组装宏基因组序列的结果显示，反硝化功能基因（narG、nirK和nosZ）的丰度显著高于硝化功能基因（amoA和hao）和DNRA功能基因（nrfA）（p<0.05，Kruskal-Wallis检验和Dunn posthoc检验）（补充材料表A9）。特别地，相比于无动物干扰的土壤，鸟类干扰的土壤中亚硝酸盐还原酶基因（nirK）和一氧化二氮还原酶基因（nosZ）的丰度更高，分别达到6.4倍（p=0.0395）和9.1倍（p=0.0301）（补充材料表A10）。此外，土壤硝酸盐含量与nosZ基因相对丰度呈显著正相关关系（r=0.67，p=0.0342），而与其他反硝化功能基因之间的关系则不显著。

我们在7个MAGs中发现了编码周质亚硝酸盐还原酶（参与DNRA过程）的 nrfA基因，它们都属于拟杆菌门（Bacteroidetes）。在37个鳍足类动物干扰土壤和55个鸟类干扰土壤的MAGs中，各发现2个和5个携带nrfA基因。此外，有5个MAGs携带硝化过程相关的基因，比如，来自鸟类干扰的土壤样品的MAG #38（属于Nitrosospiralacus）携带氨单加氧酶基因（amoA）(图3)。有3个MAGs包含完整的反硝化过程所有的必须基因，其中2个MAGs来自鳍足类动物干扰的土壤样品，1个MAGs来自鸟类干扰的土壤样品，具体为：MAG #2属于PandoraeaThiooxydans，MAG #48属于Pseudomonas stutzeri，MAG #91属于Oblitimonas alkaliphila。总体而言，大部分MAGs（89/100）只包括部分反硝化相关的基因，因此，它们可能都属于不完全反硝化菌。例如，narG基因（编码硝酸还原酶）存在于16/37的鳍足类动物干扰土壤和27/55的鸟类干扰土壤的MAGs中，该基因是丰度最高的氮循环基因（图3）；其次，nirS基因存在于5/37的鳍足类动物干扰土壤和9/55的鸟类干扰土壤的MAGs中；nirK基因存在于0/37的鳍足类动物干扰土壤和3/55的鸟类干扰土壤的MAGs中；NoB（编码一氧化氮还原酶）和nosZ（编码一氧化二氮还原酶）基因都存在于鸟类干扰土壤的MAGs中（13/55和11/55的MAGs）和鳍足类动物干扰土壤的MAGs中（8/37和7/37的MAGs）。有7个Rhodanobacter（罗丹杆菌属）。值得注意的是，在没有动物影响的土壤中获得的MAGs中没有检测到反硝化基因。有7个MAGs被鉴定为Rhodanobacter（罗丹杆菌属）近亲，其中有6个包含至少一个与反硝化有关的基因，其中有3个只编码反硝化基因中的nosZ基因（补充材料图A2）。值得注意的是，无动物干扰土壤下的MAGs中没有检测到任何反硝化基因。

6. 宏基因组组装基因组（MAGs）的地理分布特征

MAGs的构建有利于我们了解目的（氮循环）基因及其它基因的地理分布特征。为评估各样本中MAGs的适用性，我们对每个基因组的MAGs相对丰度做了热图（图3），同时利用95%的ANI基因组水平阈值确定了每个MAGs适配的基因组物种（gsp）（补充材料表A8）。结果显示，大多数MAGs仅在唯一的样本中出现、且各自有不同的gsp，这表明本研究土壤样本之间的异质性较高；总体100个MAGs中有83个不同的gsp，其中有13gsp在MAGs中出现不止一次。有趣的是，在相隔约100公里、来自不同岛屿的动物干扰土壤样本中，部分gsp来自相似的MAGs（>95%ANI）（补充材料图A3）。例如，在鸟类干扰的土壤（Pp_KGI、Pp_LI、Ld_KGI）样本中，与CandidatusTremblaya princeps相关的gsp #12来自MAG # 12和MAG #97；与Arsenicicoccus sp.相关的gsp #54来自MAG #56、MAG #77和MAG #95；与Gottschalkia acidurici相关的gsp #60来自MAG #62和MAG #71；与Rhodoferax saidenbachensis相关的gsp #61来自MAG #63、MAG #72和MAG #87；与Phycicoccus dokdonensis相关的gsp #56来自MAG #58、MAG #70和MAG #92。

本研究丰度最高的属为Rhodanobacter（罗丹杆菌属），在所有携带16S rRNA的序列中（~2%），有11个OTUs属于该属，有7个MAGs携带该属，有10%的MAGs序列与该属有亲缘关系。另外，除了MAG #67和MAG #78都包含gsp #64外，几乎所有的MAGs都包含不同的gsp。

不同MAGs宏基因组序列的多样性一定程度上代表了不同菌群序列或克隆的多样性。一般来说，序列相似性>95%代表种群离散，这与之前在其他栖息地的发现一致；序列相似性<95%代表种群重叠或说明基因组高度可变，这种情况通常比较少见。在我们的研究中，土壤中的优势属为Rhodanobacter denitrificans（69.13% AAI），其代表性基因组为 MAG #52 （补充材料图A4），以该MAG进行比对，我们发现几乎所有序列都被覆盖，这说明同源-离散群体与同源-共生群体可能同时存在。另外，文斯顿岛与乔治王岛的土壤微生物相对丰度较为相近，而后者（g_KGI、ml_KGI和Ct_KGI）丰度偏低且其群体序列离散（补充材料图A4）。此外，MAG #52在几个样本点的比对结果较差（补充材料图A5），说明该MAG不具有代表性。

讨论

1. 相比无动物和鳍足类动物干扰的土壤，鸟类干扰土壤对土壤理化因子和微生物群落多样的影响更大

本研究结果表明，鸟类干扰下土壤的含水量、有机质、磷含量和氮含量高于无动物或鳍足类动物干扰的土壤。这与我们前期的研究一致，即：企鹅干扰下土壤养分含量高于海豹干扰或无动物干扰下的土壤。类似趋势在其他研究中也有报道。这可能是由于企鹅群体较多、栖息地更为拥挤导致。尽管有研究报道南极无冰区的企鹅活动会导致土壤变酸，但在我们的研究中，企鹅干扰下土壤的pH范围较广，从中性到弱酸性，这基本与海豹干扰下土壤的酸度情况一致。

尽管土壤理化因子因动物干扰而表现出显著差异，但在本研究中，土壤微生物多样性并非如此，这可能是本研究的样本量较小导致。尽管如此，我们仍发现个别土壤的OTUs和微生物功能子系统在不同类型土壤中明显不同。原因可能是鸟类干扰下土壤的养分含量更高，以此为底物或者耐受程度高的微生物才能生存，导致总体微生物的多样性降低。事实上，我们的测序结果显示，鸟类干扰、鳍足类动物干扰和无动物干扰土壤样本中微生物群落的复杂度分别为63%、50%和32%，也因此，基于Shannon指数和Simpson_1-D指数的土壤微生物多样性结果排序为：无动物干扰>鳍足类动物干扰>鸟类干扰。

虽然土壤理化因子不能很好地解释微生物组成的变化，但我们发现，土壤pH、铵态氮、硝态氮和磷含量与微生物地理距离的相关性更高，这在既往研究中也有报道。此外，有研究显示距南极海洋动物1000 m以外的区域也有相似的养分梯度变化，这可能与“陆地生物多样性热点”有关。

2. 鸟类干扰下的南极土壤中最丰富的氮循环基因为反硝化基因反硝化基因最为丰富

N₂O排放有多种微生物途径，包括氨氧化过程、异养反硝化过程和DNRA（硝酸盐异化还原为铵）过程。硝化-反硝化相关途径已被证明是土壤N₂O排放的最主要来源。以往的研究显示，在南极地区，土壤N₂O排放与动物干扰（尤其是企鹅）有关。在本研究中，反硝化基因的相对丰度高于硝化或DNRA过程的基因，并且在鸟类干扰的土壤中，反硝化相关的nirK和nosZ基因的相对丰度最高。因此，假设DNA丰度反映其真实活性，那么在我们的研究中，经历长期、持续动物干扰的土壤环境中N₂O的排放主要源于反硝化过程，而非硝化过程。然而，矛盾的是，本研究中nosZ基因（负责将N₂O还原为N₂，导致N₂O排放减少）的丰度也很高。一方面，虽然nosZ基因的丰度较高，但其没有被充分转录或翻译，或其只能在特定条件下表现出活性（比如较高的温度条件）。另一方面，即使有大量代谢活性的nosZ酶（即nosZ基因的真实活性较高），N₂O的排放也可能高于其消耗量，或者N₂O的排放源于非生物过程。因此，为充分了解南极土壤的温室气体的排放，今后需将这些假设考虑在内。

Nelson等人发现高养分环境（如热带雨林、牧场、草原和农田）比低温沙漠中土壤氮循环相关的基因丰度更高。与之一致，在本研究中，无动物干扰的土壤中有机质和氮含量较低，该土壤中没有检测到任何与氮循环相关的基因，土壤MAGs 中也没有发现与反硝化、硝化或DNRA相关的基因。相比之下，在动物干扰的土壤中，我们发现了7个携带的nrfA基因的MAGs（参与DNRA过程），它们都属于Bacteroidetes（拟杆菌门）。大部分DNRA菌属于细菌分支。我们还发现了参与完整硝化过程的MAG #38，隶属于Nitrosospira lacus属，该菌是一种十分耐寒的氨氧化菌，具有较广的pH适应范围。反硝化过程分为完全反硝化和不完全反硝化过程，其中后者在自然环境中更为普遍。在本研究中，我们发现动物干扰的土壤中有89/92的MAGs携带不完全反硝化过程的相关基因，3/92的MAGs携带完全反硝化过程的相关基因（属于Betaproteobacteria纲）。这些结果表明，鸟类干扰下，土壤反硝化微生物丰度较高且种类较多，因此，南极土壤的N₂O排放主要由多种反硝化功能微生物负责。

3. 鸟类干扰下的南极土壤中最丰富的菌为Rhodanobacter（罗丹杆菌属）

在本研究中， MAGs分类与16S rRNA基因的物种分类结果较为一致。例如，MAGs中Proteobacteria（变形杆菌门），Actinobacteria（放线菌门）和Bacteroidetes（拟杆菌门）的优势较大，这与它们携带较高丰度的16S rRNA宏基因组序列一致。另外，我们发现有~23%携带16S rRNA基因的序列无法分类，同时，我们发现91/100的MAGs携带新型未知菌株，它们都属于不可培养细菌。这表明南极土壤样品中存在许多新的微生物物种。在构建的100个MAGs中，只有3个与现存物种高度相似（>80% AAI）。特别的是，MAG#1（92.33% AAI）和MAG #31（92.69% AAI）都与Nitrosospira briensis C128 NZ CP012371T相关，该菌株从酸性农业土壤中分离而来，是一种氨氧化菌，其营养方式为无机化能自养，对土壤生态系统功能有重要影响。尽管这两个MAGs（MAG #1和MAG #31）未检测到与氮循环相关的基因，但已有研究发现Nitrosospira属与土壤无机氮肥施用以及N₂O排放有关。这可能是由于基因组分箱步骤导致相关的氮循环基因（~70%）丢失，或者该gsp与N₂O的排放无关。MAG #43与Corynebacterium humireducens相关（89.9% AAI），该菌从连续供应废水的微生物燃料电池中分离而来，是一种能够还原腐殖酸的新型耐盐嗜碱细菌，此外，据报道，Corynebacterium humireducens菌能在厌氧条件下将硝酸盐、亚硝酸盐和一氧化氮还原为N₂O。

Rhodanobacter（罗丹杆菌属）是MAGs中丰度最高的属（65.11%~77.22%%AAI）。具体而言，Rhodanobacter在鸟类干扰土壤中丰度最高；在所有携带16S rRNA基因的序列中，约有2%属于该菌。另外，我们发现的大多数携带Rhodanobacter的MAGs代表不同的gsp，其在乔治王岛和利文斯顿岛样本中都存在。众所周知，Rhodanobacter能够在不同的土壤条件下生长，比如：近中性的pH（4-8）、高有机质、高硝酸盐、高氯化钠和重金属环境。南极土壤也与上述某些条件相似，因此非常适合Rhodanobacter生长。以往对南极的研究发现，在罗斯海地区、乔治王岛和利文斯顿岛区域，动物干扰下土壤中都有较高丰度的Rhodanobacter菌。此外，在受污染的土壤中，比如：澳大利亚南极洲的麦夸里岛石油烃污染的土壤、美国的原油污染土壤、中国的金矿污染土壤、以及美国橡树岭的核遗留土壤，也发现了较高丰度的Rhodanobacter菌。因此，在各种自然或人为干扰的生境中，Rhodanobacter菌中都起重要作用，未来研究中可将该菌作为生态干扰系统中的指示物种。

结论

总体而言，本研究发现，在南极无冰区，鸟类干扰比无动物干扰对土壤理化因子的影响更大，相应地，鸟类干扰土壤中反硝化过程相关基因 (即nirK和nosZ)和反硝化细菌-Rhodanobacter（罗丹杆菌属）的相对丰度更高。本研究的基因序列和100个宏基因组组装基因组（MAGs）可以为土壤反硝化微生物及其活性的研究提供参考（比如，为qPCR或其他分子生物方法提供参考序列）。本文的结果加深了人类对动物干扰下南极土壤氮循环功能基因及相关微生物菌群的理解，这有助于我们明确南极陆地生态系统N₂O排放与海洋动物干扰的关系。