编著：韦克蒙冯如，编辑：韦克蒙穆木希、蒋顺尧。
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导读
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人类肠道微生物组主要是通过粪便样本进行研究的，这是对胃肠道微生物群落的组成和功能的重要实践。然而，这种对粪便物质的依赖限制了对胃肠道其他部位（原位）微生物动力学的研究，而且粪便样本不能随时获得，这也妨碍了更精细的时间尺度（如小时）的分析。在我们的研究中，我们利用结肠经内镜肠内插管技术（一种最初为粪便微生物群移植而开发的技术），每天两次对回盲肠微生物群进行采样；然后对这些样本进行宏基因组和宏转录组分析。共收集了5名健康志愿者的43份回盲肠和28份尿液和粪便样本。我们发现，5名志愿者的回盲肠和粪便微生物组在宏基因组分析中是相似的，但它们的活性基因（宏转录组）却是高度不同的。两种微生物组在泻药暴露后都受到干扰；随着时间的推移，它们与前处理状态的差异减小，从而证明了肠道微生物群的一种先天属性——恢复力，尽管它们没有在我们的观察时间窗内完全恢复。在日间和夜间对回盲部微生物群进行采样，发现一系列细菌种类和功能通路中存在着昼夜节律，特别是与短链脂肪酸产生有关的细菌（如痤疮丙酸杆菌Propionibacterium acnes）和辅酶a生物合成II。自相关分析和波动分解进一步表明了菌群特征日波动的显著周期性。粪便和尿液样本中的代谢组学图谱分析反映了肠道微生物组的扰动和恢复，表明肠道微生物组对参与宿主健康的许多关键代谢物的重要贡献。这项研究为人类肠道微生物群及其内在弹性和昼夜节律，以及这些动态变化对宿主的潜在后果提供了新的见解。原名：Reconstruction and dynamics of the human intestinal microbiome observed In Situ
译名：人体肠道菌群重建和动态变化的原位观察
期刊：Engineering
IF：7.553
发表时间：2021.5.6
通讯作者：张发明&王军
通讯作者单位：南京医科大学第二附属医院消化疾病医学中心、南京医科大学整体整合肠病学重点实验室&中国科学院微生物研究所、中国科学院大学
我们对5名健康志愿者进行了渗透性泻药治疗、结肠镜检查和结肠TET操作。在泻药治疗前和在TET保持原位时每天收集粪便样本（图1）。每天上午10点和晚上10点采集回盲液2次，用生理盐水冲洗，并使用注射器通过TET采集。从5名志愿者的28份粪便样本和43份回盲部样本中提取宏基因组DNA和RNA，在Illumina NovaSeq平台上进行宏基因组和宏转录组测序分析。同时我们还采集了每个志愿者的尿液样本，并与同一采样时间的粪便样本一起进行代谢组学分析。
对固定的（基于DNA的）和活跃的（基于RNA的）微生物群落的分析显示了它们在排泄的粪便样本和回盲部样本的独特特征。在渗透性泻药处理前采集的粪便样本中，固定群落主要以Alistipes putredinis、Bacteroides stercoris、Prevotella stercorea、Faecalibacterium prausnitzii和Bacteroides massiliensis等种为主。然而，这些微生物物种/属并不总是在RNA读数中占多数；相反，在基于RNA的调查中，Ruminococcus torques、Methanobrevibacter、Subdoligranulum、Faecalibacterium prausnitzii和Ruminococcus obeum等物种更为突出（图2a）。这一观察结果通过功能通路分析得到了扩展。宏基因组DNA中最丰富的途径是腺苷核糖核苷酸从头开始的生物合成、尿苷单磷酸（UMP）生物合成、尿苷二磷酸（UDP）-N-乙酰尿酰五肽生物合成II（含赖氨酸）。UDP-N-乙酰胞壁酰-五肽生物合成 I （含中氨基庚磺酸）, 以及肽聚糖生物合成I（含中氨基庚酸）（图 2a）。腺苷核糖核苷酸从头开始的生物合成仍然是宏转录组中丰度最高的，但糖酵解IV和III、淀粉降解V和糖异生I也出现在RNA读数最高的途径中（图2a）。我们在在回盲部样本和结肠镜检查后粪便样本中观察到了类似的区别。基于DNA的微生物组成或功能分析，虽然被广泛使用，但并不代表微生物群落在活动方面的实际状态。在基于DNA的分析中，许多丰富的分类群在RNA转录方面不太活跃，而许多在宏转录组分析中高表达的代谢途径在宏基因组（DNA）读数中表达非常低（图2b和2c）。对于许多细菌物种以及代谢途径来说，情况也是相反的。
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2. 粪便和回盲部微生物组的组成和功能不同。（a）物种和功能途径水平的相对丰度概述（不同颜色代表不同物种或途径）。宏基因组与宏转录组衍生物种的比较（b）组成和（c）功能。（d）-（g）粪便和回盲样本在物种组成和功能途径方面的差异。 原位收集的回盲部微生物组与粪便微生物组相比，在分类学和功能途径上存在本质差异，这些差异主要体现在主动转录基因（宏转录组）上。在 DNA 水平上，回盲样本和粪便样本之间的物种组成和途径非常相似，没有显著差异（图 2d-2g）。然而，在转录组水平上，粪便和回盲样本显示出了显著差异。在功能途径方面，腺苷核糖核苷酸从头生物合成、糖酵解IV和III以及鸟苷核糖核苷酸从头生物合成在粪便微生物组RNA中富集，表明代谢活动很高，而糖异生I、β-D-葡萄糖醛酸和D-葡萄糖醛酸降解的超级途径、硫氨基酸生物合成的超级途径、tRNA加工和二磷酸脱氧胸苷（dTDP）-N-乙酰硫胺生物合成可能是回盲样本中最活跃的部分。经过渗透性泻药的强烈扰动，每个志愿者（H1、H2、H3、H4和H5）的粪便微生物在结肠镜检查后的几天内显示出动态恢复或重建过程。泻药治疗后最早的粪便样本与治疗前的样本相比，在DNA和RNA水平上都显示出细菌组成的差异。在基于DNA的分析中，与治疗前粪便样本中的Alistipes putredinis、Bacteroides stercoris、Prevotella stercorea、Faecalibacterium prausnitzii和Bacteroides massiliensis相比，缓泻后最早的粪便样本中的主要类群是Bacteroides plebeius、Bacteroides massiliensis（图3a）。这一发现表明，在被冲刷的过程中，不同物种对泻药的敏感性不同，或者在泻药治疗和下一次排便之间的短时间内，存在生长或恢复性变化。根据RNA分析活跃菌种表明，粪便样本中最活跃的物种从泻药治疗前的Ruminococcus torques、Methanobrevibacter_unclassified、Subdoligranulum_unclassified、Faecalibacterium prausnitzii立即转变为治疗后的Parabacteroides_unclassified,Ruminococcus torques, Collinsella_unclassified, Collinsella aerofaciens和Dorea longicatena（图3a）。在基于DNA和RNA的分析中，泻药也引起了代谢途径丰度的变化。在停止泻药后，最丰富的途径立即转变为腺苷核糖核苷酸的从头生物合成、UDP-N-乙酰月桂酰五肽的生物合成II（含赖氨酸）、奎因生物合成、DNA中的鸟苷核糖核苷酸从头生物合成和S-腺苷-L-蛋氨酸循环I，以及RNA中的腺苷核糖核苷酸从头生物合成、鸟苷核糖核苷酸从头生物合成、糖酵解IV和III以及淀粉降解V（图3a）。
图3.接触渗透性泻药后粪便和回盲样本的组成和功能的动态重建。（a）渗透前的粪便微生物组在物种和功能途径水平上与泻药治疗后的早期不同。（b-i）每个个体在使用渗透性泻药（PostF, PostI）后的（b-e）粪便和（f-i）回盲肠样本与干扰前的粪便样本（PreF）的Bray-Curtis差异。
在随后的几天里，五分之四的志愿者的粪便宏基因组和宏转录组显示出恢复趋势，这可以通过宏基因组和宏转录组与原始概况的差异随时间减少的趋势来证明，特别是在物种方面（图3b-3e）。然而，与Bray-Curtis不相似性相比，RNA 的恢复率没有显著改善。这一发现可能是由于RNA的变化较大，RNA恢复有一定的滞后，这导致恢复不像在DNA中观察到的那样明显（图 3b-3e）。PCoA 和成分分析均表明，微生物组成员之间的相互作用，以及宿主的生理因素，可能有助于微生物组在扰动后的恢复，并可能赋予微生物群落个性化的复原能力。 由于在没有结肠清洁和TET管存在残留的情况下，无法分析回盲部微生物组，因此使用回盲内容物样本测量微生物组的恢复情况可能不可行。然而，回盲部微生物组的动态变化很突出。此外，较短的采样间隔意味着可以用比粪便样本更精细的时间间隔研究回盲部微生物组的动态。尽管在同一人和同一天的不同样本类型（即回盲内容物和粪便样本）中观察到了成分和功能的区别，但回盲肠微生物组在很大程度上反映了粪便微生物组的动态。这一发现表明，回盲微生物群的变化最终导致了在粪便样本中观察到的动态（图 3f-3i）。通过DNA和RNA分析确定的主要物种，以及主要的代谢途径，在回盲样本和排泄的粪便样本中显示出类似的变化。主要物种的例子包括宏基因组读数中的Bacteroides plebeius、Bacteroides stercoris和Faecalibacterium prausnitzii，以及宏转录组读数中的Collinsella aerofaciens和Ruminococcus torques。每个志愿者的回盲样本和使用泻药前排泄的粪便样本之间的相对差异显示，五分之三个体的宏基因组/宏转录组学指标呈下降趋势，反映了泻药治疗后收集的粪便样本的情况（图3f-3i）。因此，可以假设回盲微生物组也恢复到与泻药治疗前类似的分类学/功能组成，从而显示出其自身对扰动的恢复能力。以12小时为间隔收集人体回盲部微生物样本的能力为原位研究肠道微生物组（GI）的昼夜节律提供了一个独特的机会。我们在每天上午10点和晚上10点通过TET管收集回盲样本，并在DNA和RNA水平上研究物种组成和代谢途径的动态变化。首先，根据宏基因组和宏转录组分析中对不同细菌物种的分类估计，整体群落结构在白天收集的样本和晚上收集的样本之间具有可检测的差异（图4a-4d）。此外，不同的物种在每个志愿者的DNA丰度方面显示出有规律的波动，其中一些由两个或两个以上个体共享，包括副血链球菌Streptococcus parasanguinis、长链球菌Dorea longicatena、痤疮丙酸杆菌Propionibacterium acnes、乳状瘤胃球菌Ruminococcus lactaris、毛螺菌科细菌_5_1_63FAA Lachnospiraceae bacterium_5_1_63FAA和溶血性嗜血杆菌Haemophilus haemolyticus。虽然基于DNA的丰度估计显示了不同分类群的细胞数量变化，但基于RNA的分析表明，许多细菌物种在整体基因表达（或转录活动）方面具有昼夜节律。
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4. 回盲样本中肠道微生物群的功能通路和细菌种类的昼夜节律。（a-d）PCoA 显示回盲样本中肠道微生物群的种类和功能的昼夜差异。（e-f）代谢途径和（g-h）具有昼夜波动的物种通过监测其相对丰度的变化来确定。我们进行进一步筛选，主要是在转录组数据中确定具有显著昼夜节律的通路。该分析再次揭示了代谢途径的特异性波动模式，在每个志愿者中发现了4 - 41条这样的途径（图 4e-4h）。在这些途径中，嘌呤核碱降解I、辅酶A生物合成II、L-赖氨酸生物合成I和III、5-氨基咪唑核糖核苷酸生物合成I、蔗糖降解III（蔗糖转化酶）以及L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-蛋氨酸生物合成II的超级途径被两个或更多的志愿者个体共享，而其余途径只限于一个人。相比之下，宏基因组数据中相应的代谢途径没有显示出明显的波动模式，这表明这些途径的转录调节是昼夜模式的基础，而不是宏基因组中基因拷贝的增加或减少。一类普遍的代谢途径与短链脂肪酸（SCFAs）的生产有关，包括丙酮酸发酵成乙酸和乳酸II，以及乙酰-CoA发酵成丁酸II，还有宏转录组数据中的乙炔降解。这些代谢途径一般在白天比较活跃，而在夜间不那么活跃。时间序列滞后自相关检验证明了昼夜节律的重要性；我们在DNA和RNA中分别检测到17条和15条具有明显昼夜节律的代谢途径。这些代谢途径大多与辅酶A的生物合成有关（十分之七），辅酶A有助于SCFAs的生物合成。此外，与SCFA生物合成功能相关的物种也有显著变化，如痤疮丙酸杆菌Propionibacterium acnes。
图5.具有最显著昼夜波动的代谢途径。选取在Box-Pierce和Ljung-Box检验中p值最显著的10条代谢途径（分别对应DNA和RNA中的H1、H2、H3、H4和H5）作为例子，（a-e）宏基因组和（f-j）宏转录组。 此外，我们把昼夜节律波动分解为昼夜变化和长期趋势，并观察到昼夜振荡和趋势之间的密切振幅。此外，长期趋势似乎是恢复性的，而昼夜振荡表明回盲微生物组的周期性（图5）。用傅里叶函数计算的带有外部回归因子的ARIMA模型的预测结果也表明，这些代谢途径和物种的相对丰度显示出良好的未来昼夜节律，但没有恢复的趋势。4 结肠镜检查后，粪便和尿液代谢组与微生物组组成恢复为了进一步证明肠道微生物组的紊乱和恢复对宿主的潜在影响，我们对泻药治疗前收集的粪便和尿液代谢组，以及结肠镜检查后获得的粪便样本进行了调查。首先，与泻药治疗前的样本相比，结肠镜检查后的粪便代谢组显示出明显的差异。由于渗透性泻药的作用，代谢物的丰度明显下降，尤其是瓜氨酸、N-乙酰-L-蛋氨酸、L-谷氨酸、N-乙酰谷氨酸、别鹅脱氧胆酸、亚油酸、油酸、5-羟基吲哚乙酸、泛酸、黄嘌呤、羟基嘌呤醇、4-三甲基氨基丁酸和石胆酸（VIP > 1, FDR< 0. 05）。粪便样本中的代谢组在结肠镜检查后进行了动态重建，并与微生物组的恢复密切相关，导致与干扰前的粪便样本的代谢组相对相似（图6）。然而，不同程度上，活性物种的组成（由宏转录组数据决定）与代谢组变化的关联最强。总之，在渗透性泻药治疗期间，粪便代谢物也被扰乱，并在停止治疗后与肠道微生物组一起重建；因此，重建可能影响宿主的代谢。
图6.接触渗透性泻药后粪便和尿液样本中代谢物的动态重建。（a）每个个体（H1、H2、H3、H4和H5）在每个采样时间内相对丰度最高的10种主要代谢物的条形图，包括渗透前（Pre）和渗透后（Post）收集的粪便和尿液样品。（b）每个个体的渗透性泻药后（Post）的粪便或尿液样品与干扰前（Pre）的样品相比的Bray-Curtis异同度。微生物组也促进了尿液代谢组组成和重建的变化，尽管程度比粪便代谢组要小。随着肠道微生物的耗尽，尿液代谢组中减少的代谢物较少，最突出的代谢物只有近乎显著的减少（7-甲基黄嘌呤，VIP>0，p=0.087）。与粪便样本相比，结肠镜检查后收集的尿液样本的代谢组显示了较少但仍可检测到的恢复，反映了肠道微生物组的转变。对粪便中表现出减少的代谢物的进一步富集分析表明，微生物衍生的代谢物在许多生理和病理状况中的潜在重要性。metaboAnalyst分析显示，这些代谢物的变化与许多代谢综合征，包括Hartnup病和短肠病，以及中枢神经系统疾病，如癫痫和精神分裂症有明显的关联。这一发现再次证实，肠-脑轴的运作主要是通过各种微生物代谢物进行的。富集结果还包括受昼夜变化影响的代谢物。由于一些代谢物在很大程度上依赖于肠道微生物的存在，可以认为肠道微生物组的昼夜变化是代谢物本身昼夜变化的基础。在本研究中，我们利用最初为结肠输送粪便微生物或药物而设计的结肠TET技术，在泻药治疗后在原位持续收集粪便样本和回盲部样本。对收集的样本进行了宏基因组、宏转录组和代谢组的组合分析，以描述人类肠道微生物组的组成、功能和多层动态特征。该研究还揭示了微生物组组成和功能重建的个体性，总体上显示了肠道微生物组内部复原力的共同特征。对回盲部微生物组进行原位采样的能力，以及在频繁的固定时间点进行采样的能力，首次提供了对人类肠道微生物组的昼夜模式或昼夜节律的独特见解。根据特定的细菌群和代谢途径，可以得出结论，且这种节律发生在整个群落水平。当在DNA（“固定”）和RNA（“活跃”）水平上检查时，细菌种类和代谢途径都会有不同的模式。在排泄出的粪便样本中，一系列的细菌物种，包括Ruminococcus、Subdoligranulum和Faecalibacterium属的成员，在转录和潜在的代谢方面都非常活跃。这些细菌是丁酸盐的生产者，我们已知丁酸盐在代谢和免疫方面，特别是在一些代谢紊乱以及自身免疫性疾病的情况下，对宿主至关重要。最主要的代谢途径是腺苷核苷酸的从头生物合成，这与三磷酸腺苷（ATP）的产生有关，因此与DNA和RNA的能量循环有关。除此途径外，转录组数据中高度活跃的所有其他代谢途径都与营养物质的代谢有关（如葡萄糖代谢），而与细胞结构有关的途径（如细胞壁的成分）在DNA样本中最为丰富。这一发现表明，在针对微生物生理活动的不同部分的途径中，存在着异质性的转录调控。在用泻药清洁结肠后，粪便微生物组首先在组成和功能上显示出巨大的变化；然而，与治疗前的微生物组相比，这些区别在后来的时间点逐渐减少。考虑到与粪便样本同时采集的回盲样本之间的紧密联系，可以得出结论，回盲微生物组也在动态地重建。这种重建具有高度个体特异性的特点，即不同的细菌种类/代谢途径在每个个体中恢复到比较相似的丰度。然而，微生物组的重建也显示了微生物复原力的共同特征，即它们在总体上变得与泻药治疗前的微生物组越来越相似。许多研究报告了肠道微生物组在急性干扰后的长期稳定性和复原力，包括饮食干预、药物治疗等。服用一剂泻药后微生物组的变化为这种复原力提供了另一个证明，这种复原力是建立在微生物物种的内部相互作用上的。每天两次定期的回盲部采样为人体消化道微生物组的昼夜模式提供了有趣的见解。在回盲部样本的宏转录组分析中，产生丁酸盐的细菌再次构成了显示出强烈昼夜模式特征的大多数物种。这可能是对食物摄入和/或胃肠道内宿主生理变化的反应。与SCFAs产生有关的代谢途径属于最突出的昼夜模式，这些SCFAs已被认为是影响宿主昼夜节律的关键因素。最近报道指出，宿主肠道上皮细胞的昼夜节律可受MyD88依赖的组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）基因表达变化的影响，而且已知HDAC的活性也受SCFAs的影响。这些发现不仅揭示了菌群在白天或夜间的复制动态和代谢活动，而且还可能为肠道微生物群-宿主串联这一途径提供最终的微生物线索。与之前在小鼠身上进行的一项研究相比，本研究中的志愿者在结肠镜检查前只接受了一剂结肠清洁泻药。因此，肠道微生物组显示出了恢复状态，而不是长期的菌群失调——这一发现与临床观察结果一致，即结肠镜检查一般不与消化系统的长期不良影响有关。在目前的研究中，由于TET管脱落后，相应的回盲肠采样不再可行，因此没有收集足够长时间的粪便样本来确定肠道微生物组是否完全恢复。如果使用2-4个夹子进行内镜固定，结肠TET管在结肠内停留的时间一般为1-2周。对回盲肠样本代谢组的分析也有局限性，因为回盲肠样本是水洗过的，稀释程度无法确定，这使得代谢物的量化很困难。最后，宿主的反应只能通过粪便和尿液样本的代谢组来推断；尽管如此，还是观察到了与微生物组相似的恢复情况，这一发现再次证实了肠道微生物组对代谢物的贡献。此外，大部分微生物衍生的代谢物可能是重要的代谢和中枢神经系统功能的基础，再次证实了肠道微生物组对宿主代谢和肠脑轴的贡献。然而对宿主反应的更直接测量，包括宿主肠道上皮基因的表达，在人类中还无法实现，只能在实验动物中进行研究。总之，本研究以比以往观察更精细的时间频率，调查了泻药干预后的肠道微生物组重建和回盲部微生物组在原位的相应重建特征。首次提供了人类回盲部微生物组在组成和功能层面上的昼夜模式的直接证据。在多组学水平上对粪便和回盲肠微生物组动态的理解，有助于理解肠道微生物生态系统本身，以及它如何潜在地影响宿主的生理过程，包括昼夜节律。
