编撰：魏经行，编辑：魏、蒋顺尧。
导读
胆囊宏基因组涉及广泛的未知序列，包括所谓的宏基因组暗物质。因此，研究人员提出了一种新的基于远程同源性和分子建模相结合的数据分析策略。根据获得的结果，在宏基因组的暗物质部分注释了几个蛋白质功能域，包括乙酰转移酶、外膜转运蛋白、膜组装因子、DNA修复和重组蛋白以及应答调节磷酸酶。此外，三个胆囊宏基因组和一个fosmid文库，重点是宏基因组暗物质分数,在.这种酶可能在放线菌中起保护作用，防止胆汁成分暴露，这与许多抗生素和多药耐药基因的存在是一致的。通过分子模拟阐明了这种新型脱乙酰酶的潜在作用机制，突出了组氨酸和天冬氨酸残基的作用。这项工作中提出的计算管道可能对发现以前没有被表征的新微生物酶特别感兴趣。
fosmid文库的宏基因组暗物质部分中发现了一种参与放线硫醇生物合成的脱乙酰酶
论文ID原胆汁宏基因组的功能特征：宏基因组暗物质的研究
名：,译,名:宏基因组暗物质研究中胆汁宏基因组的功能特征
：期刊微生物公司
：4.128
IF：2021年10月21日
发表时间：通讯作卡洛斯萨巴特
者：高等学术研究委员会(CSIC)，阿斯图里亚斯乳品研究所(IPLA)
通讯作者单位：10.3390/micro organism 91201
DOI号：
实验设计
从胆囊获得的人胆汁宏基因组的特征强调蛋白质和被赋予抗生素抗性的蛋白质，以及几个功能未知的蛋白质功能域，包括所谓的宏基因组暗物质。为此，研究员结果与讨论
研究人员选择了胆汁fosmid文库和鸟枪法宏基因组序列进行研究。fosmid文库通过TORMES软件进行分类和鉴定，揭示了五个主要门：厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、Epsilonproteobacteria和放线菌门。根据以往研究中胆汁样品的16S测序实验，可以发现这些门也是最丰富的。FOS文库中的主要科包括：茎杆菌科、奇诺菌素科、拉克诺菌素科、丙种杆菌科、鞘氨醇球菌科、乳球菌科、木霉菌科、瑞克氏菌科、伯克霍尔德氏菌科、拟杆菌科、链霉素科、肠杆菌科和压力杆菌科，与Molinero报道的用于制备fosmid文库的胆汁样品的16S测序数据一致。同样，在fosmid文库中发现的主要属包括鞘氨醇单胞菌属、阿利斯替普属、拟杆菌属、链霉菌属、巴尼耶氏菌属、普雷沃氏菌属、别雷沃氏菌属、拉克诺司皮拉属和一个未分类的穆里巴科属，它们也通过胆汁样品的16S测序进行了检测。因此，采用了一种涉及两个不同步骤的综合数据分析策略：（1）ARG和MDR的识别，（2）通过远程同源性和计算化学技术初步确定宏基因组暗物质结构域的生物功能。.这些结果表明，fosmid文库可以捕获胆汁微生物区系中的主要细菌群，这与现有文献中的研究一致。
738462"/>图1 热图显示胆汁宏基因组样本H-04、H-05和H-06，fosmid文库和用作对照的肠道宏基因组样本中多药耐药基因 (MDR) 的丰度。这些丰度表示为相对百分比(%)。MDR根据从Pfam数据库中检索到的参考代码进行注释。样本之间的相似性也用树形图来说明，并表示为它们的特征MDRs谱之间的距离，这些特征MDRs谱由完全连杆法计算(垂直轴)。
1. 胆汁宏基因组的功能分析：抗生素和多药抗性基因 之 前推测具有抗生素耐药性的基因——ARGs的存在已被确定（补充材料表S1）。fosmid文库的序列被包括在随后的分析中。已有研究证明细菌对氨苄青霉素和四环素等几种抗生素的耐药性可能与胆汁盐的存在有关。从这个意义上说，研究者已经开发了包含ARG、MDR和蛋白质的参考数据库，包括Resfinder、CARD和TCDB。此外，目前有自动确定ARG的计算管道可用。
关于宏基因组样本，H-04显示ARG对最广泛的抗生素产生了耐药性：阿莫西林、氨苄西林、头孢菌素、头孢菌素、氯霉素、强力霉素、林可酰胺、大环内酯、米诺环素、单菌胺、青霉烯、青霉烯、哌拉西林、四环素、链霉素四环素和替卡西林。H-05显示了ARGs对多西环素、米诺环素、四环素以及氨基糖苷类抗生素的强耐药性。相比之下，在H-06样品中只发现了一种对氯霉素具有抗性的ARG，这可能是由于其reads数较低和Molinero之前报道的未分配序列的百分比较高。然而，在fosmid文库中我们发现了最多种类的ARG，尽管ARG丰度（表示为每个序列兆碱基对每种抗生素产生抗性的ARG数量）在胆汁宏基因组样本中观察到的范围内（补充材料表S1）。这些结构域赋予了ARG对氨基香豆素、氨基糖苷类、阿奇霉素、碳青霉烯类、头孢菌素、头霉素、氯霉素、二氨基嘧啶、红霉素、氟喹诺酮、磷霉素、甘氨酰环素、林可酰胺、大环内酯、单酰胺菌素、硝基苯甲胺唑、戊唑啉、戊唑啉、戊唑啉、、链球菌素、四环素、三氯生和甲氧苄啶的耐药性。先前的研究表明，在胆汁盐存在的情况下，Salmonella typhimurium对氨苄青霉素和四环素的耐药性增加，并且在H-04、H-05胆道宏基因组和fosmid克隆的序列中也发现了几种赋予这两种抗生素耐药性的ARGs，这表明胆汁可以选择这些特定的耐药性。有趣的是，在fosmid文库中首次发现了几种参与多药耐药的蛋白质，包括GadW和GadX（促进mdtEF表达以赋予多药耐药性的两种AraC家族调节因子）、多药耐药蛋白MdtH和多药耐药脂质转运蛋白MsbA，后者是一种细菌细胞活力必不可少的ABC转运蛋白。使用基于Pfam和TCDB数据库的补充分析对其他MDR域进行了注释。
根据获得的结果，与Kovatcheva-Datchary等人测序的对照肠道宏基因组相比，来自样本H-04的fosmid文库和胆汁宏基因组中的几种MDR更丰富（图1）：（1）来自Actinobacteria（出口氟喹诺酮类和氯霉素）的PF00083多药耐药外排泵，（2）来自Proteobacteria的PF00529多药耐药泵成分，（3）来自Proteobacteria的PF00873多药外排泵，（4）以阳离子亲脂性药物的Proteobacteria为底物的PF00893多药外排泵，(5) 来自Proteobacteria的PF02321抗性外排泵复合物，(6) 来自Proteobacteria的PF04632多药耐药蛋白，(7) 来自Actinobacteria和Proteobacteria的PF07690多药耐药外排转运体。相比之下，肠道宏基因组中的其他结构域更为丰富（图1）：（1）来自Actinobacteria的PF00005多药耐药输出蛋白，（2）来自Actinobacteria的PF00664多药外排泵，（3）来自Proteobacteria的PF01554多药耐药外排泵。在用作对照的Kovatcheva-Datchary等人测序的胆汁和粪便宏基因组之间未发现来自Actinobacteria的PF01061的多药耐药性输出因子的丰度存在差异（图1）。一般来说，与肠道宏基因组相比，胆汁样本显示出更高的MDR丰度。据报道，一些细菌发展出多重耐药策略来抵抗胆汁的杀菌活性。这一事实可能归因于主要胆汁成分，如胆汁酸和盐、胆固醇和胆红素，它们可能与自由基发生反应，从而导致胆囊生态系统中的氧化应激。先前的研究强调，胆盐暴露引起的氧化应激会刺激抗生素耐药机制和MDR表达。这些机制允许细菌与胆汁盐一起在某些生态位中存活。在这方面，一些MDR转运蛋白显示出双重活性，能够转运胆汁盐和抗生素。据报道，细菌氧化应激促进多药耐药基因在细菌属内和细菌属之间的水平转移，作为一种防御反应。在本研究中鉴定的多药蛋白对应于Actinobacteria和Proteobacteria，这是胆囊微生物群中最重要的两种门。先前比较胆囊和肠道微生物群代谢能力的研究表明，胆囊微生物群显示出更高丰度的参与胆汁酸代谢以及胆汁和多药耐药性的基因。因此，可以合理地假设胆汁微生物群比肠道微生物群受到更高的氧化应激，从而导致更高的MDR丰度。
胆汁宏基因组中几种ARG和MDR的鉴定表明，胆囊微生物群构成了抗生素抗性细菌的储存库。从这个意义上说，胆汁是一种天然存在于人体中的杀菌化合物，在减少胃肠道中的细菌负担和帮助消化方面发挥着重要作用。胆汁释放到肠腔是胃肠道转运的重要步骤，肠道病原体可能会接触胆汁中存在的抗生素抗性细菌。病原体与胆道微生物群的相互作用可能导致水平基因转移，允许细菌交换其遗传物质，包括ARG和MDR。因此，肠道病原体可能会对抗生素和其他杀菌成分产生新的抗性机制，并使用胆汁作为定位信号来调节毒力基因表达并增强感染。因此，胆囊微生物群中ARG和MDR的存在可能对人类健康具有相关意义，并且对于了解这些抗菌素耐药机制以开发成功的治疗方法和临床干预措施是必要的。
2 胆汁宏基因组的功能分析：宏基因组暗物质
胆汁宏基因组的功能分析揭示了几种ARG和MDR的存在。然而，宏基因组reads中发现的各种蛋白质功能域的生物学功能仍然未知。为了加深对这些序列的研究并提出这些新域的潜在活性，研究者如先前建议的那样采用了远程同源技术。根据获得的结果，在与对照参考数据库进行比对时，共有8个没有域族同源物的蛋白质编码序列簇，在使用远程同源性技术进行谱-谱比较期间显示出高概率（超过90%）发挥一定活性（表1）。在这些新的功能域中，发现了两种涉及乙酰转移酶和1D-肌醇2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷脱乙酰酶活性的酶。此外，还鉴定了其他非特异性结构域，例如两个外膜转运，包括铁转运蛋白、外膜组装因子、DNA修复和重组蛋白以及响应调节剂磷酸酶。尽管远距离同源性无法完全阐明其特定功能，但也确定了一种双结构域蛋白质结构。将这些功能域在胆汁样本中的分布与在来自健康个体的40个粪便宏基因组中观察到的分布进行了比较，这些宏基因组是在之前的一项研究中预先组装的。从表1中可以看出，大多数宏基因组暗物质功能域是从H-04样本和fosmid文库中依次确定的，而在H-06中没有确定功能域，可能部分是由于过滤的数量少从该样本中获得的reads和先前分配的序列的百分比更高。相比之下，H-05显示出与肠道宏基因组相似的模式，其中仅鉴定了一种外膜蛋白组装因子。
表1 利用远程同源性技术鉴定胆汁宏基因组样本H-04、H-05和H-06，fosmid文库和作为对照的肠道宏基因组样本的宏基因组暗物质部分中注释的几个功能域。
有趣的是，在fosmid文库中发现的假定的1D肌醇2-乙酰酰基-2-脱氧-α-D-葡萄糖吡苷去乙酰化酶催化1D肌醇2-乙酰酰基-2-脱氧-α-D-葡萄糖苷水解形成1D-肌醇2-氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷和醋酸盐，放线硫醇生物合成的第四个整体步骤。放线硫醇是放线菌门中主要的低分子量硫醇，通过保护细胞免受活性氧和活性氮中间体的侵害，对于该门受到氧化应激的生存至关重要。如前所述，放线菌门是胆汁宏基因组中确定的主要门类之一，与其他研究一致，包括3-13%的胆囊微生物群。此外，已经证明放线硫醇在保护细胞免受抗生素等有毒化合物侵害方面发挥着关键作用。这一事实可以解释在fosmid文库中存在参与放线硫醇合成的假定酶，该样本显示了最广泛的ARG和MDR。据推测，fosmid文库是使用经受最大氧化应激的样品生成的。应该指出的是，放线硫醇有助于活性氧的解毒，其水平会随着生长条件（如氧化应激）的变化而变化。因此，在这些条件下，参与放线硫醇生物合成的基因可能会被上调。另一方面，H-04在其宏基因组暗物质部分显示出最广泛的膜蛋白。
Molinero等人对胆囊微生物群进行的功能分析揭示了与上述一些代谢功能相关的直系同源基团簇的存在，包括复制、重组和修复域、信号转导机制、细胞外结构和无机离子转运蛋白。从这个意义上说，与本研究结果一致，据报道，与粪便微生物群相比，胆道微生物群富含膜转运蛋白。另一方面，在Song等人的研究中，在胆囊癌患者的胆汁样本中观察到更高比例的脱乙酰酶和氨基酸转运蛋白，突出了脱乙酰酶的潜在作用，这些酶也存在于宏基因组暗物质部分。Molinero等人报告的最大功能域簇涉及具有未知功能的胆汁宏基因组序列（占总序列的 24.5-30.8%）。应该考虑到，由于难以获得固体活检或液体以及细菌负荷低，胆汁宏基因组的可用信息很少，与相对知名的人类生态系统（如肠道微生物群）相比，会导致大量未分类的序列。因此，注释未识别序列的新方法可能会引起人们极大的兴趣。在目前的工作中，已在宏基因组暗物质部分中鉴定出胆汁特异性蛋白质功能域，包括参与保护性化合物生物合成的酶，这些酶可能在细菌对胆汁暴露的抵抗力方面发挥关键作用。
鸟枪宏基因组测序和fosmid文库制备是研究胆囊微生物群的两种互补方法。Fosmid文库对DNA浓度没有限制。然而，鸟枪宏基因组学需要从可能难以处理的生物样本（如胆汁样本）中分离出最少的高质量DNA浓度。这种优势对于表征低细菌生物量生态位（如胆囊）特别有用。此外，fosmid文库允许研究许多未在宏基因组文库中完全捕获的完整基因。另一方面，鸟枪法宏基因组学的劳动密集度较低，比fosmid文库更快地产生测序数据，并避免了通过PCR或活性引导的功能宏基因组学工作流程引入的常见偏差。在本研究中，使用fosmid文库可以从微生物暗物质部分中鉴定新的乙酰转移酶和脱乙酰酶。这些新的功能域无法被鸟枪法宏基因组测序捕获，并突出了fosmid文库制备对胆汁微生物群等几乎没有生态位的功能表征的适用性。
图2 (A) Ramachandran图显示了由同源建模生成的假定1D-肌醇2-乙酰氨基-2-脱氧-α-吡喃葡萄糖苷脱乙酰酶的3D结构的 phi (φ) 和psi (ψ) 角值。点代表酶结构中包含的单个氨基酸残基的Φ和ψ角。图中的彩色区域表示与可能的扭转角的偏好（绿色）和允许（浅绿色）组合相对应的允许区域。可以观察到，在不允许的区域（白色）中找不到氨基酸残基，表明结构模型适合进行进一步分析。(B) 1D-肌醇-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-吡喃葡萄糖苷与假定的1D-肌醇2-乙酰氨基-2-脱氧-α-吡喃葡萄糖苷脱乙酰酶的重新对接结果。说明了蛋白质结构中底物的对接和结合构象之间的相似性。颜色代码分配给存在于1D-肌醇 2-乙酰氨基-2-脱氧-α-吡喃葡萄糖苷中的不同原子：绿色（碳）、氢（白色）、氧（红色）和氮（蓝色）。应该注意的是，该图说明了两个结构（停靠和重新停靠）的叠加。叠加的对接和重新对接的构象非常相似，突出了分子对接模拟的可重复性。
分子模拟技术研究宏基因组暗物质的生物学功能存在于胆汁宏基因组暗物质部分中的一些蛋白质功能域的假定功能已通过远程同源技术的剖面-剖面比较进行注释。然而，这些方法仍然依赖于序列比较，并且这些参与生物过程的结构域的作用机制可能难以确认。为了加深对未识别reads中发现的潜在酶的表征，研究者提出了基于分子建模技术的宏基因组暗物质序列的补充分析。在上一步注释的蛋白质功能域中，假定的1D-肌醇2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷脱乙酰酶可能是最具生物学相关性的。因此，已经通过计算化学方法阐明了存在于fosmid文库中的该功能域的潜在作用机制。为此，首先通过同源建模生成了该功能域序列的可能3D结构。本文通过Ramachandran图 (图2a) 评估生成的3D结构的质量。所有氨基酸残基均存在于构象空间的允许区域，没有观察到Ramachandran异常值。此外，质量指标Q-Mean和Z-score分别为-0.8和1.9，表明该模型对模拟的适用性。
通过分子对接研究了该酶功能域与其相应底物（1D-肌醇2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷）之间的相互作用机制。根据获得的结果，AutodockVina给出的前九个位置的平均亲和力值为-3.82±0.22 kcal mol-1。负值表明与假定酶的活性位点结合的底物是热力学有利的反应，正如预期的那样。
分子对接模拟揭示了假定的酶与其相应底物之间的几种化学相互作用，主要由活性位点的天冬氨酸 (ASP) 或组氨酸 (HIS) 催化残基与底物的羟基或乙酰氨基之间的极性接触组成。这些交互机制如图3所示，并在之后进行讨论：
图3 由分子对接确定了fosmid文库宏基因组暗物质部分中所注释的1D-肌醇2-乙酰氨基-2脱氧-α-吡喃葡萄糖苷与假定的1D-肌醇2-乙酰氨基-2脱氧-α-吡喃葡萄糖苷去乙酰酶之间的潜在互作机制。底物与活性位点的天冬氨酸 (ASP) 和组氨酸 (HIS) 残基之间的极性接触用黄色高亮显示。键距以埃 (Å) 表示。
残基ASP97与2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷单体的羟基和乙酰氨基的氧原子相互作用，键长分别为2.85和3.50 Å。残基ASP97与1D-肌醇羟基的氧原子相互作用，键长为2.75–3.14 Å。残基HIS99与1D-肌醇单体羟基的氧原子相互作用，键长为3.32 Å。HIS100和ASP103残基与2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷单体羟基的氧原子相互作用，键长分别为3.15和2.83 Å。
为了评估分子对接模拟的可重复性并确保研究结果的质量，研究者将底物重新对接到重复的假定酶的活性位点（n=10）。比较了基板的对接和结合构象，显示通过两种结构（图2B）和低值RMSD（0.097±0.064 Å）的叠加评估的高度相似性。
这里描述的相互作用机制类似于几位作者使用实验方法以及计算机技术（如分子对接和分子动力学模拟）针对类似酶报告的机制。这些作者还强调了ASP和HIS残基的催化功能。已经描述了这些残基从底物形成氢键、羟基，这也可以用于介导底物的结合并使葡糖胺定向为适合催化的构象，与本研究结果一致。
图4 在fosmid文库的宏基因组暗物质组分中注释的假定的1D -肌醇2-乙酰氨基-2-脱氧-α-吡喃葡萄糖苷去乙酰酶的每个氨基酸残基对酶-底物复合物总结合能的贡献。个体能量贡献最大的是存在于推测酶活性部位的组氨酸残基 (HIS)。
这里描述的亲和力值低于先前通过充分表征的细菌1D-肌醇2-乙酰氨基-2脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷脱乙酰酶与其底物分子对接获得的结合能。然而，很少有研究报告这些复合物的结合能，而分子对接结果用于粗略估计化合物与靶标的相对结合亲和力，并且通常与结合能的实际值没有很好的相关性。为了克服这个限制，分子动力学模拟是一种更先进的技术，被用来计算更准确的结合能。根据所得结果，MM/PBSA法测定的结合能酶底物复合物为-10.97±0.08kcal mol-1，在Huang等报道的结合能范围内。对于类似的酶，使用分子建模技术。计算了每个氨基酸残基对总结合能的单独贡献，并在图4中进行了说明。正如预期的那样，活性位点中存在的那些氨基酸（主要涉及ASP和HIS残基）显示出负能量（突出底物与该区域的结合模式）。据报道，HIS介导吡喃糖结合，而ASP在此类酶中充当催化酸。这一事实可以解释观察到的HIS残基的最高能量贡献，在底物与活性位点的结合中起关键作用。
在胆汁宏基因组的暗物质部分中发现的假定的1D-肌醇2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-葡萄糖苷脱乙酰酶的分子模型已被用于确认远程同源剖面比较所提示的潜在酶活性。这种新方法可能对发现以前未被表征的新型微生物酶特别感兴趣。为了说明该方法未来的潜在应用，还按照此处描述的计算工作流程分析了更复杂和更丰富的宏基因组，例如粪便宏基因组。为此，选择了Kovatcheva-Datchary等人获得的粪便宏基因组。该数据集包含来自健康个体的40个肠道宏基因组，在之前的数据分析步骤中用作对照（图1，表1）。在肠道宏基因组中发现的宏基因组暗物质部分的计算阐明显示存在多达1509个新的蛋白质编码序列。在这些序列中，792个蛋白质编码序列的生物学功能通过远程同源性进行了注释。此外，注释了新的碳水化合物活性酶，包括三个β-半乳糖苷酶结构域（新的β-半乳糖苷酶1、2和3）。90.0%、42.5%和45.0%的研究中的肠道宏基因组中存在新型β-半乳糖苷酶1、2和3。有趣的是，远程同源性分析表明，新型β-半乳糖苷酶2属于Roseburia hominis，一种新兴的潜在有益细菌，可能对人类健康产生积极影响。然后，通过同源建模生成新型β-半乳糖苷酶的3D结构模型（补充材料图S1中提供了新型β-半乳糖苷酶结构的示例）。进行分子建模以研究新型β-半乳糖苷酶与从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/上次访问：2021年9月30日）检索的β-半乳糖苷酶的三种常见底物之间的相互作用机制：邻硝基苯基葡萄糖苷(ONPG)、乳糖和40半乳糖基-乳糖（代表性的低聚半乳糖结构）分别导致-6.0、-5.7和-6.0kcal mol-1的亲和力值。正如所解释的，负亲和力值表明底物与假定的β-半乳糖苷酶的活性位点结合是热力学有利的反应。重新对接酶-底物复合物以评估该方法的再现性。正如预期的那样，基板的对接和结合构象显示出高度的相似性（补充材料图S2）。新型β-半乳糖苷酶与这些底物之间存在的潜在化学相互作用如图5所示。研究者发现了底物的羟基与β-半乳糖苷酶活性位点的天冬氨酸(ASP)和酪氨酸(TYR)残基之间的化学相互作用。这些相互作用与先前作者在分子模型研究中报道的β-半乳糖苷酶的特征作用机制一致。因此，使用远程同源性和分子建模技术的组合，已经在肠道微生物群的宏基因组暗物质部分中鉴定了来自促进健康的肠道共生体的新型β-半乳糖苷酶。
图5 由分子对接确定的在肠道宏基因组的暗物质部分中注释的新型β-半乳糖苷酶 2与几种底物之间的潜在相互作用机制：（A）邻硝基苯基葡萄糖苷（ONPG），（B）乳糖，（C）4’半乳糖基-乳糖。底物的羟基与活性位点的天冬氨酸(ASP)和酪氨酸(TYR) 残基之间的潜在接触以黄色突出显示。键距以埃(Å) 表示。
很少有研究开发特定的计算流程和软件包来分析由当前宏基因组测序技术产生的微生物暗物质部分。先前作者开发的替代方法涉及序列的系统发育邻居分析，以评估可用完整基因组代表微生物群落的程度，以及对未知细菌的网络分析，以研究它们在来自所有环境的复杂微生物生态系统中的作用。然而，这些方法没有提供宏基因组暗物质部分中存在的蛋白质结构域的潜在生物学功能的详尽注释。从这个意义上说，已经报道了应用远程同源性来注释未识别的编码序列。另一方面，最近的研究表明，分子建模是阐明细菌酶的潜在作用机制的宝贵工具。因此，两种技术（远程同源性和分子建模）的结合可用于注释新的蛋白质序列，并确保这些序列显示出与特定类型蛋白质相关的特征作用机制。据我们所知，没有现有的软件允许对新型细菌酶及其化学作用机制进行详尽的注释。在目前的工作中，一个新的脱乙酰酶域被远程同源注释。然后，该域的分子建模揭示了基于潜在酶-底物相互作用的脱乙酰酶样行为。为了通过实验验证这里提出的计算方法，未来的研究将涵盖细菌中的重组蛋白表达和新型酶的功能结构分析。酶的结构构象将与这项工作中提出的计算机模型进行比较，以改进计算预测。
结论
目前的工作提供了胆道微生物组的综合表征，重点是ARG、MDR和宏基因组暗物质分数。研究者鉴定了ARG和MDR，显示了其在fosmid宏基因组文库中的最高丰度。在宏基因组暗物质部分中已经注释了几个蛋白质功能域，包括乙酰转移酶、外膜转运蛋白、膜组装因子、DNA修复和重组蛋白以及响应调节磷酸酶。此外，已在fosmid文库的宏基因组暗物质部分中注释了一种新的细菌脱乙酰酶，该酶参与分枝硫醇生物合成并可能对放线菌发挥保护作用。这种新型脱乙酰酶的潜在作用机制已通过分子对接和分子动力学模拟阐明，突出了来自活性位点的组氨酸和天冬氨酸残基的作用。此外，酶-底物复合物的结合能已被估计（-10.97±0.08 kcal mol-1）。这种综合方法允许对涉及细菌对胆汁成分的抗性的多个基因和酶进行详尽的表征。远程同源性和分子建模技术的结合为宏基因组暗物质中存在的功能域提供了更深入的表征，并可用于未来的新酶发现研究。
